lonza 無血清 培養基

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現貨促銷：無血清造血細胞培養基

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摘要：

通常，動物細胞的生長均有賴于血清的存在，在普通培養基中，如不加血清，絕大部分細胞不能增殖。目前，血清培養基中通常添加的比較好的血清是牛血清。經研究發現細胞培養中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的風險：由于不同批次牛血清間的生物活性和因子的不一致，導致產品和實驗結果的重現性差：制品中殘留的牛血清易引起接種者對血清的過敏反應。

第一章 無血清培養基概述

通常，動物細胞的生長均有賴于血清的存在，在普通培養基中，如不加血清，絕大部分細胞不能增殖。目前，血清培養基中通常添加的比較好的血清是牛血清。經研究發現細胞培養中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的風險：由于不同批次牛血清間的生物活性和因子的不一致，導致產品和實驗結果的重現性差：制品中殘留的牛血清易引起接種者對血清的過敏反應。

無血清培養基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義，就是在細胞培養中不需要添加血清，但是在某些應用中可能要添加生長因子或細胞因子。無血清培養基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養物質和激素等，能減少血清帶來的不利因素，使細胞培養的條件更穩定。經歷了天然培養基、合成培養基后，無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可簡化純化和鑒定各種細胞產物的程序，避免病毒污染造成的危害。

一、無血清細胞培養基及其優缺點

(一)無血清培養基及分類

無血清培養基是繼天然培養基，合成培養基之后的第三類培養基。與傳統的培養基相比較，無血清培養基是不含動物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養基。無血清培養基由于其組成成分相對清楚，制備過程簡單，在現代生物技術學領域得到廣泛應用。無血清培養技術也是闡明細胞生長，增值，分化及基因表達調控的基礎研究問題的有力工具。

目前，無血清培養基的研究有兩個方向：一是培養基中不含有任何動物來源的添加組分;二是培養基中不含有不明確的添加組分。依此可以將當前應用較多的無血清培養基歸納為以下四種：

1.一般意義上的無血清培養基，用各類可代替血清功能的生物材料配制細胞培養基，如牛血清白蛋白(BSA)，轉鐵蛋白，胰島素等生物大分子物質，以及從血清中提取的去除蛋白質的混合脂類以及水解蛋白等。其特點是培養基中的蛋白含量較高，添加物質的化學成分不明確，其中含有大量的動物來源蛋白。

2.無動物來源培養基：許多商業公司開發的無動物來源培養基是基于生產重組藥物的安全考慮，培養基中的添加組分無動物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細胞生長及增殖的需要。

3.無動物蛋白培養基：培養基完全不用動物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養基組分相對穩定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對培養的細胞是高度特異性的。

4.化學組分限定培養基，此類培養基是目前最安全的，最為理想的培養基，首先可以保證培養基批次間的一致性，其中所添加的少量動物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組分。其特點是培養基的性質確定，配起培養基來也比較方便。

(二)無血清培養基的優缺點

無血清培養基的優點：

1. 可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養和實驗結果的重復性。

2. 避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3. 避免血清組分對實驗研究的影響。

4. 有利于體外培養細胞的分化。

5. 可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。

6. 組分穩定，可大量生產。

7. 不含有絲分裂原抑制劑，可以促進細胞增殖。

無血清培養基的缺點：

⒈ 細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不 如傳統的合成培養基方便。

2. 成本較高。

3. 針對性很強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。

4. 處于發育的不同分化階段的細胞(例如干細胞與定向前體細胞相比)需要不同的配方，對生長因子和細胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時，也去除了一些血清蛋白具有的保護、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。

二、無血清培養基組成及主要添加因子

無血清培養基由營養完全的基礎培養基添加激素，生長因子，貼壁因子和結合蛋白而組成。

(一)基礎培養基

早期用于細胞培養的基礎培養基有血漿凝塊，淋巴液，大豆蛋白胨和胚胎浸膏等天然培養基。1950年Morgan等在前人的研究基礎上研究出199培養基，是動物細胞培養基發展到一個嶄新的階段，及合成培養基階段。合成培養基是按細胞生長需要將一定比例的氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖等組合成的基礎培養基。目前市場上已經有上百種的合成培養基商品。在眾多的合成培養基中，MEM、DMEM、RPMI 1640、F12、和TC100的使用最為廣泛。

基礎培養基的成分是完全已知的，因此在對不同的細胞株進行培養時可以對基礎培養基的某些組分進行相應的調整，以更好的符合細胞株的營養要求或提高目的蛋白的表達量。

(二)主要添加因子

又稱補充因子，是代替血清的各種因子的總稱。多數無血清培養液必須補加3—8種因子，任何單一因子都不能取代血清。已知有100多種此類因子，其中有些是必須補充因子，如胰島素、亞硒酸鈉和轉鐵蛋白，其他多數為輔助作用的因子。

按其功能不同，我們可將補充因子分為四類：

1.激素和生長因子

很多細胞用無血清培養時需要加入激素，如胰島素、生長激素、胰高糖素等。幾乎所有的細胞系都需要胰島素，它是一種多肽，能與細胞上的胰島素受體結合形成復合物，促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，一致細胞凋亡，是重要的細胞存活因子。細胞無血清培養中，胰島素的使用濃度為0.1-10μg/ml。Jan等認為在批式培養中胰島素迅速耗盡是細胞比生長速率下降的主要原因。此外甲狀腺素等和甾體類激素中的孕酮、氫化可的松、雌二醇等也是無血清細胞培養是常用的補充因子。不同細胞株對激素的種類和數量要求有所不同。

生長因子是維持細胞體外培養生存、增殖和分化所必需的補充因子。按化學性質可分為多肽類生長因子和甾類生長因子。無血清培養基中添加的生長因子主要是多肽類生長因子，近些年已鑒定的多肽類生長因子已有20-30種，其中半數以上都可以通過基因重組的手段獲得相應的重組生長因子。無血清培養基較常見的生長因子有表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和神經生長因子(NGF)等。生長因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細胞群體倍增時間。

2.結合蛋白

結合蛋白有兩種，一種是轉鐵蛋白，另一種是白蛋白。

大多數哺乳動物細胞上存在特定的轉鐵蛋白受體，受體與轉鐵蛋白與鐵離子的復合物結合是細胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源，此外轉鐵蛋白還具有生長因子的性質并能與其他微量元素如釩等結合。不同細胞對轉鐵蛋白的需要量也不同。

白蛋白也是無血清培養基中常用的添加因子。它通過與維生素、脂類、激素、金屬離子和生長因子的結合而穩定和調節上述物質在無血清培養基中活性的作用，此外還有結合毒素和減輕蛋白酶對細胞影響的作用。

3.貼壁因子

絕大多數的真核細胞在體外生長時需要固著在適宜的基底上。細胞固著作用是一個復雜的過程，包括貼壁因子吸附于器皿或載體的表面。細胞與貼壁因子的結合等。無血清培養中常用的貼壁因子有細胞間質和血清中的成分，如纖粘連蛋白、膠原、昆布氨酸和多聚賴氨酸等。

4.其他添加因子

一些細胞系的無血清培養還需要補充某些低分子量的化學物質，如微量元素、維生素、脂類等，維生素B主要以輔酶的形式參與細胞代謝，維生素C和維生素E具有抗氧化作用。丁二胺和亞油酸等提供細胞膜合成所需的脂質和細胞生長所需的水溶性脂質。

三.無血清培養基的應用

目前在大規模動物細胞的培養中已經普遍適用于無血清培養基。在疫苗生長、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應用領域中，優化無血清培養基的成分可使不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目的產物的環境中維持高密度培養，降低生產成本。在人類細胞培養中，應用無血清培養基還能有選擇性地控制及避免成纖維細胞的過度生長。在無血清培養條件下，某些細胞的生長量和抗體的產量甚至較有血清時高出數倍。

除生產生物制品外，無血清培養基也被廣泛應用于細胞生物學、藥理學、腫瘤學領域：

(1)研究細胞的分化條件：無血清培養基其組成可以是完全確知的化學物質，因而可根據研究的需要增減具有重要生物活性物質的種類和數量。這就為研究細胞分化的條件提供了有效的手段。

(2)用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究。

(3)用于從多種細胞混雜的培養中選擇目的細胞：通過對無血清培養中的某些成分的取舍，可抑制原代組織培養物中非目的細胞的過度生長，達到選擇目的細胞的目的。

(4)腫瘤病理學和病因學的研究：如用于研究致癌因子對細胞的影響，研究腫瘤細胞對可能觸發正常細胞終末分化的外周信號的反應能力，或用于研究正常細胞與腫瘤細胞的生長和移行與基底膜信號的關系等。

(5)無血清培養基在生物制品生產中的得到廣泛應用，國內外的很多生產單位都在致力于如何將無血清培養基與發酵罐培養技術更好的結合應用。

另外，無血清培養基還廣泛應用于干細胞和免疫細胞的研究和臨床治療中。且在此領域對無血清培養基的需求量最大而且最迫切。

第二章 競爭對手

第一節 國際競爭對手

調查方法：在對方公司網站上獲取產品信息。以武漢大學研究生身份，以從事干細胞研究，需培養干細胞為由向其國內的代理公司發郵件詢價獲得產品價格和產品的詳細資料。

Invitrogen旗下Gibco品牌(以下關于Gibco的內容，除價格部分是通過網絡詢價獲取外，其他皆從該公司網站上截取)

(一)減血清培養基Advanced™ media - require less sera

減少血清用量具有許多好處

(1)減少血清用量可以解決許多日常細胞培養中面臨的成本、供貨、質量、一致性和法規問題。

(2)以更低的成本獲得可重復的結果(dvanced™ DMEM, DMEM/F-12, RPMI, and MEM)

可重復的結果：血清批間差較小意味著細胞培養條件的變化比較小

降低了成本：血清用量少并且測試的批次量也更少，因而降低了實驗室開支

GIBCO® Advanced™ media are enhanced basal media formulations of DMEM, DMEM/F-12, MEM, and RPMI 1640. 這些培養基含有豐富的正常血清成分，使用時所需的 FBS 更少 (50–90%)，卻能獲得相同或更好的細胞生長效果，并且在許多常用細胞系，沒有發現細胞形態或功能的改變

對于許多標準細胞系而言，可以直接使用 Advanced™ 培養基取代傳統培養基。 對幾種細胞系的研究表明，與傳統培養基 (5% FBS) 相比，Advanced™ 培養基 (1–2% FBS) 可提供相同或更好的生長效果，同時也不會使細胞發生形態上的改變(圖 1)。由圖中可以看出，使用更少的血清獲得相同的生長效果

Standard RPMI 1640 supplemented with 4 mM L-glutamine and 5% FBS was compared to Advanced™ RPMI 1640 supplemented with 4 mM L-glutamine and 5%, 2%, 1%, or 0.5% FBS.以合適的密度分別將 SP2、Jurkat、VERO、Raji 和 Daudi 細胞接種在 25-cm2 燒瓶中，并于 37?C、含 5% CO2 和 95% 空氣的增濕培養箱中培養兩代，每四天傳代一次。 第三代時，將細胞適當地接種至 24 孔板中，并如上所述孵育七天。 第 5 天的平均細胞計數(三個平行樣品)記錄如下。

Figure 1. Growth comparison of multiple cell lines in standard RPMI 1640 supplemented with 5% F BS to Advanced™ RPMI 1640 supplemented with 0.5% to 5% FBS.

應用：

a. 推薦用于待測細胞系的添加劑 ;

b. 直接替代基礎培養基。

對于大多數應用和多種細胞系而言，無需通過逐步切斷養分或馴化的方法，即可將血清添加劑至少減少 50%。 Provided in a 1x liquid format, Advanced™ DMEM, DMEM/F-12, MEM, and RPMI 1640 only require the addition of GlutaMAX™-I Supplement or L-glutamine and the appropriate reduced amount of serum to make complete media.

Advanced™ 培養基是值得信賴的 GIBCO® 產品

GIBCO® 產品以顧客需求為中心，自始至終都保持高品質、創新和優質服務。 GIBCO® 產品始終提供最佳的質量、一致性和性能，使結果持續可靠。 種類最廣泛的細胞培養產品、一流的服務和久經驗證的性能 - GIBCO® 產品的質量和一致性讓用戶放心。 當重復性好的結果至關重要時，請使用 GIBCO® 產品。

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(二)無血清培養基










 

第二節 國內競爭對手

國內生產無血清培養基的較知名企業有廣州賽業，北京清大眾一等，但國內生產的無血清培養基無論從質量上還是從口碑上都與GIBCO和Hyclone的產品相去甚遠，且產品線尚不完善。

第三章 無血清培養基市場容量分析

無血清培養主要用于生命科學領域，所有需要進行細胞或組織培養的機構均需使用。目前國內外生產廠家規模小，產量低，尤其是國內廠家，尚沒有進行大規模生產的廠家。隨著實驗技術的進步，對無血清培養基的需求越來越大。本項目產品適用培養的細胞譜較廣，有望占領大部分國內市場甚至一部分國際市場。

無血清培養基在進行干細胞培養方面具有巨大的市場潛力，市場容量和市場需求量都不可估量。在各國政策的鼓勵下，目前國內外從事干細胞研究和治療的機構眾多。有報道稱：2009年，全國的干細胞實驗室有50個。而到今年，這個數字應該是以幾何指數增長。目前，全球有229家公司從事干細胞治療心臟病的研究。預計干細胞治療心臟病的市場總額在2012年將達到35億美元。在美國，組織工程產品正以每年市值增加22.5%的速度成為國民經濟的支柱產業之一。同樣，干細胞治療的市場規模也在不斷擴大，預計到2012年心臟病的干細胞治療市場規模將達35億美元。我國SFDA已逐漸放寬對人類胚胎干細胞臨床試驗的限制，而據生物谷研究院統計，在接下來的五年中，中國的干細胞與再生醫學相關領域的市場規模將達到60億元，不論是臨床研究的準入標準，還是干細胞研究的研發外包，甚至關聯與干細胞與再生醫學研究服務的機構，都將在這個產業鏈中占有巨大的市場份額。因此在全球再生醫學產業化形成的初期及早介入，將在下一輪產業爆發過程中占得先機。

溫家寶總理2009年在中科院成立60周年紀念活動及與首都科技界大會上的重要講話中指出：“目前，世界主要發達國家的干細胞研究發展勢頭強勁。干細胞研究促進了再生醫學的發展，這是繼藥物治療、手術治療之后的又一場醫療革命。我們要力爭在干細胞研究的更多領域取得領先地位”。從當今的發展趨勢看，再生醫學已是現代臨床醫學的一種嶄新的治療模式，對醫學治療理論、治療和康復方針的發展有重大的影響，也是近年來包括中國在內的世界各國政府重點發展和研究的高新科技領域之一。

從近年來的快速發展和再生醫學所展現的前景看，它已經成為醫學研究領域中的一個新的學科，重視再生醫學不僅是學科發展、臨床應用的需要，同時也是國際競爭的需要[1,2]。目前我國已形成了一支優秀的干細胞研究隊伍，通過加大投入，假以時日，完全有能力在干細胞與再生醫學研究領域贏得一席之地甚至搶奪制高點。

1. 干細胞與再生醫學已成為生物醫學國際競爭的一個焦點

干細胞的商業前景及其對改善人類健康的價值無疑是巨大的，這使它成為當今國際間競相追逐的焦點之一。到目前為止，美國、英國、德國、意大利、荷蘭、法國、瑞典、比利時、捷克、以色列、加拿大、中國、日本、韓國、新加坡、印度、澳大利亞、南非、巴西等越來越多的國家和地區紛紛投入到這一領域中。正是由于干細胞與再生醫學既能給現有臨床治療模式帶來深刻變革，又是21世紀具有巨大潛力的新興高科技產業之一，因此國際上已形成了國際性的科技競爭和產業化競爭的熱潮，再生生物學產品正逐步成為衡量一個國家或地區科技發展水平與健康水平的重要標志之一，世界各國均紛紛斥巨資參與這一領域的研究與開發。2000年，全球從事再生生物學產品開發的企業為66家，2002年已增至99家，其中僅美國就有50家，目前已經形成價值60億美元的產業，并以每年25%的速度遞增。據預測，到2015年左右，美國的再生醫學產品部分將有4 000億美元的營業額，倘若加上治療前后的相關費用，市場將會達到10 000億美元，成為美國經濟的支柱性產業之一。

我國是世界第一人口大國，因創傷、疾病、遺傳和衰老造成的組織器官缺損或功能障礙人數位居世界之首。我國每年燒傷、燙傷病人達500萬—1 000萬例;乙肝病毒攜帶者為1.2億，丙肝病毒攜帶者為1 500萬人，其轉化為乙型肝炎與丙型肝炎的比例分別為20%和50%，即2 400萬人和750萬人，部分患者將最終發展成肝硬化或肝癌，每年因終末期肝病死亡約30萬人，其中約50%死于肝癌;糖尿病已成為繼心腦血管性疾病和腫瘤之后位居第三位的嚴重危害人類健康的慢性非傳染性疾病;我國60歲以上人群的帕金森氏病發病率為1.5%，70歲以上人群升至2%。我國對再生醫學產品的需求將位居全球之首，但隨著我國加入WHO，知識產權保護日益成為我國突出的科學技術問題，因此，加強對再生醫學的研究與開發，加大投入，盡快獲得擁有自主知識產權的再生醫學產品成果，已是醫學研究領域中的當務之急。

2 我國已具有一支相當規模的干細胞與再生醫學研究隊伍

圍繞再生醫學所開展的干細胞研究已受到世界各國政府和全世界科學家的高度重視。政府和企業均已在此領域投入巨資開展相關研究，而且大量與干細胞和再生醫學有關的研究機構不斷涌現，許多大學已成立專門的干細胞和再生醫學研究機構，比如美國的哈佛大學、耶魯大學、加州大學，英國的劍橋大學、牛津大學，日本的理化所、東京大學與京都大學等知名大學和研究機構均成立了再生醫學研究中心或干細胞研究中心。在美國大學里干細胞實驗室的數量在大幅度攀升，從事與之相關研究的人員正在以驚人的速度增加。此外，美國加利福尼亞州政府投資30億美元建立了再生醫學研究所，而且各大藥物研發公司——例如著名的Pfizer，也組建了再生醫學研究部門，等等。在2009年公布的中國科技發展2050年路線圖中，提出了作為新興學科的干細胞和再生醫學，必須在我國大力發展的策略。作為世界上最大的資助生物醫學研究的NIH也專門設立了再生醫學行動計劃，而且已經啟動了相關的研究計劃開展再生醫學研究，并有著名專家呼吁NIH應設立專門的干細胞和再生醫學評審組[3]。美國科學院在深入研究了干細胞與再生醫學的前景后，已建議美國國會加大對干細胞與再生醫學的投入。

作為再生醫學基礎的干細胞研究，我國與世界幾乎同時啟動。國家自然科學基金委在成立之初便資助過動物干細胞建系方面的研究;1999年將人類干細胞建系研究列為重點招標領域;2000年科技部也將干細胞研究列為“973”招標領域。之后我國對干細胞的研究一直給予了連續的支持，特別是iPS技術出現后，國際上的再生醫學研究呈現跨越式發展。幾年來，國家和地方政府均對干細胞和再生醫學有大量投入，國家科技部還設立了干細胞與再生醫學的“973”和“863”專項。近期，科技部將干細胞與再生醫學列為繼生殖與發育、蛋白質科學、量子科學、納米科學之后的第五個重大專項，充分反映了我國對該領域的高度重視。中科院已將干細胞和再生醫學研究列入未來戰略性科技先導專項，在“十二五”期間，計劃投入9億人民幣資助80個以上的實驗室開展相關研究。

許多從事分子生物學研究的科學家也紛紛轉向干細胞和再生醫學研究領域，使我國形成了一支具有一定實力、在一些領域具有鮮明特色的研究隊伍。中科院已將相關的實驗室組建為研究聯盟，此外不少大學也成立了干細胞研究聯盟，而且許多研究單位也成立了相關的部門實驗室，估計從事干細胞和再生醫學研究的實驗室達到300個以上。國家發改委已經成立了兩個干細胞工程中心，其目的就是讓再生醫學走向臨床。國家自然科學基金委近年受理的與干細胞和再生醫學研究相關的項目也呈現急劇增加的趨勢。

以上是對干細胞研究和干細胞在市場的潛力的分析，因為無血清培養基在干細胞培養方面的市場也是巨大的，所以也從側面反映了無血清培養基的市場容量巨大。面對如此巨大的市場，對于致力于開發用于干細胞培養的無血清培養基的我們來說，無疑是一個非常好的機遇，但同時也是一場巨大的挑戰。

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