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SDS 高鹽法(方案1) 具體步驟: 稱取1g 土壤,放入研缽中,倒入適量的液氮,立即研磨;再倒入適量的液氮,研磨,重復(fù)3 次,使土壤顆粒研成粉末; 將13.5 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鹽[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L ) 與5 g 土壤置于50 ml 的離心管中,放入37 ℃恒溫?fù)u床上,225 r·min - 1振蕩30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,輕輕混勻,65 ℃水浴加熱2 h ,每隔15～30 min 輕輕搖勻1 次;5 000 r·min - 1離心10 min ,將上清液轉(zhuǎn)入新的50 ml 離心管中;取4.5 ml 提取緩沖液加入原離心管,搖勻泥漿,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同樣的離心速度離心10 min ,將上清液與原上清液合并;再重復(fù)此步驟1 次; 用與上清液等量的三氯甲烷于離心管中混勻,5000 r·min - 1離心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫靜置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1離心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去離子水,溶解粘附于離心管壁的DNA 及其雜質(zhì),并收集于1.5 ml 的微型離心管中. 變性劑加SDS 高鹽法(方案2) 具體步驟： 取1 g 土樣和等量的滅菌石英砂在研缽中混合,加入1 ml 變性劑(4 mol/L異硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巰基乙醇) ;液氮冰凍,研磨至溶解,重復(fù)3 次; 轉(zhuǎn)入50 ml 離心管中,加入9 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鈉[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 輕輕混勻1 次;5 000 r·min - 1 離心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取緩沖液,混合后,65 ℃水浴10min ,離心,取上清,合入上述上清液;重復(fù)一次;加入等體積的氯仿混合,5 000 r·min - 1離心20 min ,取上清;加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1離心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3） 稱取1g土壤樣品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸緩沖液，玻璃珠振蕩1min。溶菌酶5mg，使終濃度為2.5mg/ml,室溫振蕩15min,放置冰箱30min，加125μl 20%SDS振蕩處理15min，離心，分裝EP管，加酚（1：1體積），抽提1次，氯仿-異戊醇（1：1體積），抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置1h,離心，70%乙醇清洗，200μl TE 溶解。 凍融溶菌酶SDS裂解法（方案4） 取1g土壤樣品，加如0.5ml滅菌的抽提緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻璃珠旋渦5~10 min，在液氮中冷卻1 min后迅速在沸水中煮2 min，如此重復(fù)3次，13 000r/min離心10 min。上清夜快速置于冰上備用，沉淀用于進(jìn)一步裂解。將上述沉淀懸浮于0.2ml提取緩沖液中，旋渦10min，加入溶菌酶（100ml/l）50μl,輕輕混勻后，37C溫浴30min，再加入250μl SDS 緩沖液（100 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol/l NaCl,2.0% SDS, PH8.0）,上下顛倒10min，13000 r/min離心10min,收集上清夜。 二、DNA純化 葡聚糖-200凝膠G離心層析純化 取2ml滅過菌的一次性塑料注射器，用注射器推桿將滅過菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度約為0.5cm，然后向注射器筒中加入TE緩沖液浸透的葡聚糖凝膠G-200，制成簡式離心層析柱，再置于10ml的離心管中，于高速冷凍離心機(jī)上以3000r/min離心20min，去除葡聚糖凝膠G-200中的TE緩沖液，將離心層析柱再置于另一10ml的離心管中，在離心層析柱頂部加入50μl粗土壤DNA，以10 min為周期于3000r/min離心，分別收集層析液。層析液濃縮至50μl 三、DNA的瓊脂糖凝膠電泳 證明存在DNA。 四、DNA 的純度和定量檢測 用紫外分光光度計(jì)測量純化后的DNA 溶液在波長為230 nm、260 nm、280 nm 下的OD 值，分別算出A260 /A230 及A260 /A280 值。來估計(jì)DNA的純度。 五、純化后土壤DNA 的PCR擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系為50μL ,模板為1μL 。PCR反應(yīng)引物（放線菌通用引物）: 反應(yīng)條件: 94 ℃ 3 min 預(yù)變性; 94 ℃ 1 min , 56 ℃1 min ,72 ℃1 min ,30 個(gè)循環(huán);72 ℃補(bǔ)平5 min。PCR 產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。 六、檢測擴(kuò)增結(jié)果 凝膠電泳，用溴乙錠染色，在紫外光下檢查結(jié)果。 FastDNA® SPIN Kit for Soil 網(wǎng)址鏈接 http://www.gducity.com/a/gb2312/yiqi/MP%20Bio/2012/0802/4857.html |
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