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2014年12月28日，蘇州大學基礎醫學與生物科學學院王晗課題組，在國際著名學術期刊《Journal of BioLogical Chemistry》發表一項最新研究成果，題為“The zebrafish Period2 protein positively regulates the circadian clock through mediation of RAR-related orphan receptor alpha (Rorα)”。 在這項研究中，研究人員利用TALEN技術，成功制備了兩種斑馬魚per2無效突變體，闡明了Per2在斑馬魚生物鐘中的基本功能，并為PER2在脊椎動物晝夜節律系統中的積極作用，提供了關鍵的證據。 本文通訊作者為蘇州大學基礎醫學與生物科學學院博士生導師、特聘教授王晗，其本科畢業于安徽大學，獲中科院碩士學位，美國韋恩州立大學博士學位，曾在美國佐治亞醫學院、俄勒岡大學和俄克拉荷馬大學從事博士后研究和助理教授，2009年至今，任蘇州大學醫學部基礎醫學與生物科學學院特聘教授、國家重大研究計劃項目首席科學家。主要研究方向為生物鐘分子遺傳和基因組調控機制、生物鐘對生殖和發育的影響、生物鐘進化的分子遺傳和基因組機制等領域，曾在Nature Genetics、Development、Evolution和Journal of molecular Evolution等雜志發表40余篇學術論文。 生物鐘，從生物對地球上光/暗周期長期和持久的適應進化而來，可以被當地環境因素(例如光、甚至食物)復位和同步，可以在大約24小時的一段時間內調節行為和生理學。在幾種生物(包括藍藻、粗糙脈孢菌、黑腹果蠅和小鼠)中進行的一系列遺傳和生化研究，已經確定了晝夜節律調控的分子遺傳機制。 斑馬魚(Danio rerio)是研究生物鐘的一種極好模型，具有與果蠅和哺乳動物類似的晝夜節律調控組件。光照和溫度是斑馬魚關鍵的夾帶生物鐘因素，特別是，斑馬魚外周組織可以直接響應光信號，產生節律性。 兩個光受體(Tmt視蛋白和Opsin4.1)，已被證明對于斑馬魚外周生物鐘的光夾帶至關重要。此外，光可以調控生物鐘，對斑馬魚的細胞周期和DNA損傷修復產生影響。盡管轉錄/翻譯為基礎的回路也被認為在斑馬魚中起作用，但是斑馬魚和哺乳動物之間的晝夜節律調控存在顯著的差異。 哺乳動物Period2作為晝夜節律鐘的一個典型組分，在晝夜節律、睡眠、代謝和致癌作用中起著重要的作用。在人類當中，一個PER2錯義突變通過CK1δ廢止磷酸化作用，并導致家族性睡眠期綜合征(fasPS)。小鼠Per2是一個光反應基因，其在視交叉上核(SCN)中的晝夜節律時相和表達振幅，可根據不同的光/暗周期而有所改變。 斑馬魚Per2也是一個光調節基因，在恒定黑暗條件下它的表達顯著減弱。利用轉基因魚和穩定轉染的細胞系分析方法，研究人員確定了一種由Per2中D-baox和E-box基序組成的光響應模板(LRM)。此外，斑馬魚per2是生物鐘控制的aanat2表達、編碼褪黑素合成限速酶所必需的。 盡管所有這些重要的研究進展都與斑馬魚per2有關，但是斑馬魚per2沒有酶原穩定的遺傳突變，這對于確定其在斑馬魚生物鐘調控以及其他生命過程中的作用非常關鍵。 最近，基因組編輯工具鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活樣效應物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9已被發展用以產生位點特異性的DNA雙鏈斷裂(DSBs)，可觸發內源性非同源末端連接(NHEJ)DNA修復途徑，以誘導許多物種(包括斑馬魚)中靶基因的插入缺失突變。 在這項研究中，研究人員利用TALEN成功制備了兩種per2無效突變體(null mutant;由于大片段插入、缺失或重排而導致基因產物完全無效)斑馬魚。運動實驗表明，Per2突變體斑馬魚在LD(光-暗)條件下和DD(持續黑暗)條件下2小時的相位延遲，表現出活動減少，實時定量PCR分析表明，在per2突變斑馬魚中，cry1aa、cry1ba、cry1bb和aanat2基因表達上調，但是per1b、per3和bmal1b基因表達下調，從而表明Per2對于斑馬魚生物鐘是必不可少的。熒光素酶報告基因分析表明，Per2可通過E-box抑制aanat2表達，并通過RORE增強bmal1b表達，從而說明Per2在斑馬魚生物鐘中起著雙重作用。細胞轉染和co-IP試驗表明，Per2可通過與orphan核受體Rorα結合，增強bmal1b的表達。 該研究還確定，PER2在Bmal1表達中的積極作用，從斑馬魚到小鼠都是保守的，差異在于，斑馬魚的Per2可通過與Rorα(而不是Rev-erbα)結合增強bmal1b表達，而小鼠PER2對Baml1表達的增強作用，仍然需要RORα介導，即使它與REV-ERBα(而不是RORα)結合。此外，斑馬魚Per2似乎在許多外周器官中有特異性的調控作用。 總而言之，這些結果有助于闡明Per2在斑馬魚生物鐘中的基本功能，并為PER2在脊椎動物晝夜節律系統中的積極作用，提供了關鍵的證據。
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