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 在20世紀(jì)80年代后期，科家學(xué)們開始嘗試用嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T細(xì)胞進行實驗，當(dāng)時三名研究人員通過基因工程改造T細(xì)胞使其表達(dá)識別半抗原的抗體并重定向其特異性^1-2。

 2011年，Carl June和他的團隊報道了一例使用自體抗CD19 CAR-T細(xì)胞（CAR-T19）成功治愈的一名慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）病患³。2017年，首款CAR-T療法—諾華制藥“Kymriah”的獲批，堪稱為“免疫療法的里程碑”，成功宣告CAR-T技術(shù)在商業(yè)化臨床的使用。迄今為止，已有眾多CAR-T細(xì)胞的相關(guān)文獻發(fā)表，描述從CAR-T細(xì)胞的設(shè)計、開發(fā)到臨床應(yīng)用。在這一期的微信中，我們回顧了最近在CAR-T細(xì)胞研究領(lǐng)域里的一系列重要進展，并探討了從實驗室到臨床采用T細(xì)胞療法的深遠(yuǎn)意義。

設(shè)計更好的T細(xì)胞

細(xì)胞治療的第一步，是需要從患者身上分離T細(xì)胞，并進行激活、擴增和遺傳修飾，以表達(dá)體外識別所選抗原的CAR。在這個階段，有許多因素需要加以考慮，其中包括靶點選擇和遺傳修飾的方法。

  1. 靶點選擇

CARs是合成的跨膜受體，其含有賦予抗原特異性抗體的胞外scFv結(jié)構(gòu)域，和一種細(xì)胞內(nèi)組分，這種細(xì)胞內(nèi)組分通常包括CD3ζ和協(xié)同刺激（比如CD28、4-1BB、OX-40）信號域，以模擬T細(xì)胞信號（圖1）^4-5。在抗原識別后，CAR-T細(xì)胞被激活并啟動它們的效應(yīng)子功能，比如細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性，其最終導(dǎo)致任何表達(dá)靶點抗原細(xì)胞的消除。由于腫瘤抗原通常也在非惡性細(xì)胞上表達(dá)，因此，靶點選擇在CAR-T細(xì)胞設(shè)計中是一項挑戰(zhàn)。

圖1. 嵌合抗原受體（CAR）的結(jié)構(gòu)

摘選自CAR-T細(xì)胞制備的掛圖，通過Nature Protocols制作并由STEMCELL Technologies提供支持。以下研究表明可以通過特異性靶點的選擇，來減少CAR-T細(xì)胞療法副作用：

• Targeting AFP-MHC complex with CAR T cell therapy for liver cancer⁶

  Clinical Cancer Research, 2017

  利用靶向AFP-MHC復(fù)合物的CAR-T細(xì)胞治療肝癌。

• Precision tumor recognition by T cells with combinatorial antigen-sensing circuits⁷

  Cell, 2016

  使用組合抗原感應(yīng)環(huán)路使T細(xì)胞更精確地識別腫瘤。

• Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy⁸

  Cell, 2017

  觸發(fā)廣泛的系統(tǒng)免疫對有效的癌癥免疫療法是必需的。

 2、遺傳修飾

通過對T細(xì)胞遺傳修飾表達(dá)CAR，其被重新定向至一特定的靶點。目前，最常用的遺傳修飾T細(xì)胞的方法是使用病毒（比如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒）的載體，這些工程化載體可以攜帶CAR構(gòu)建體⁹。簡言之，T細(xì)胞被激活，然后用可將其攜帶的物質(zhì)釋放進細(xì)胞的病毒顆粒進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致CAR構(gòu)建體插入轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞基因組里（圖2）。最近，Li等人發(fā)表了關(guān)于使用EasySep^TM分離的T細(xì)胞的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生和T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的完整方案¹⁰。 

    圖2. 通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞

摘選自CAR-T細(xì)胞制備的掛圖，通過Nature Protocol制作，并由STEMCELL Technologies提供支持。以下研究闡述了通過對T細(xì)胞進行遺傳修飾來定向特定的靶點：

• Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4+ T cells¹¹

  Molecular Therapy, 2016

  全基因組分析揭示在人原代CD4+T細(xì)胞里MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒插入位點的選擇特性和piggyBac轉(zhuǎn)座子之間有著顯著的相似性。

• Evaluation of TCR gene editing achieved by TALENs, CRISPR/Cas9, and megaTAL nucleases¹²

  Molecular Therapy, 2016

  通過TALENs、CRISPR/Cas9和mega TAL核酸酶實現(xiàn)的TCR基因編輯的評估。

• In situ programming of leukaemia-specific T cells using synthetic DNA nanocarriers¹³

  Nature Nanotechnology, 2017

  使用合成的DNA納米載體原位編程白血病特異性T細(xì)胞。

3、新概念

實驗室里的前沿研究在CAR-T細(xì)胞設(shè)計中不斷提出了各種新的、令人興奮的概念。以下研究介紹了一些關(guān)于T細(xì)胞傳送的新概念：

• Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy¹⁴

  Nature Biotechnology, 2015

  生物聚合物植入體增強了過繼性T細(xì)胞療法的功效。

• Engineering T cells with customized therapeutic response programs using synthetic Notch receptors¹⁵

  Cell, 2016

  使用人工合成的Notch受體制備具有定制治療反應(yīng)程序的工程化T細(xì)胞。

    想了解CAR-T細(xì)胞的最新研究進展包括以上文獻的具體內(nèi)容，請點擊這里。

參考文獻

1. Gill S et al. (2016) Chimeric antigen receptor T cell therapy: 25 years in the making. Blood Rev 30 (3): 157-67.

2. Gross G et al. (1989) Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 86 (24): 10024-8.

3. Porter DL et al. (2011) Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 365: 725-33.

4. Srivastava S et al. (2015) Engineering CAR-T cells: design concepts. Trends Immunol 36(8):494-502.

5. Fesnak AD et al. (2016) Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 16: 566-81.

6. Liu H et al. (2017) Targeting alpha-fetoprotein(AFP)-MHC complex with CAR T-cell therapy for liver cancer. Clin Cancer Res 23(2): 478-88.

7. Roybal KT et al. (2016). Precision tumor recognition by T cells with combinatorial antigen-sensing circuits. Cell 164(4): 770-9.

8. Spitzer MH et al. (2017). Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell 168(3): 487-502.

9. Dai H et al. (2016) Chimeric antigen receptors modified T-cells for cancer therapy. J Natl Cancer Inst 108(7).

10. Li G et al. (2017) Gammaretroviral production and T cell transduction to genetically retarget primary T cells against cancer. Methods Mol Biol 1514: 111-118.

11. Gogol-Döring A et al. (2016) Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4+ T cells. Mol Ther 24(3): 592-606.

12. Osborn MJ et al. (2016) Evaluation of TCR gene editing achieved by TALENs, CRISPR/Cas9, and megaTAL nucleases. Mol Ther 24(3): 570-581.

13. Smith TT et al. (2017) In situ programming of leukaemia-specific T cells using synthetic DNA nanocarriers. Nat Nanotechnol 12(8): 813-20.

14. Stephan SB et al. (2015) Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy. Nat Biotechnol 33(1): 97-101.

15. Roybal KT et al. (2016) Engineering T cells with customized therapeutic response programs using synthetic Notch receptors. Cell 167(2): 419-32.

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