例如，慢病毒傳遞系統(tǒng)的一個(gè)常見用途是插入短的發(fā)夾RNAs (shRNA)，用于RNAi介導(dǎo)的基因敲除。

shRNA首先被包裝成慢病毒載體，然后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育約3天，此間慢病毒復(fù)制和產(chǎn)生慢病毒顆粒，然后收獲，評價(jià)滴度，再轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞。

維持細(xì)胞的良好狀態(tài)是必要的。HEK293細(xì)胞生長迅速，胰蛋白酶化速度快，所以不要在胰蛋白酶中長時(shí)間孵育，否則可能會(huì)有大量細(xì)胞死亡。

解凍后的細(xì)胞應(yīng)至少傳代兩次，然后接種進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。并且要非常輕柔地處理，因?yàn)榧?xì)胞很容易分離。

在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，HEK293細(xì)胞接種于約5*10^6細(xì)胞/10cm培養(yǎng)皿中，接種后次日細(xì)胞約40-50%融合。

在實(shí)驗(yàn)的包裝部分使用無血清培養(yǎng)基是非常重要的。無血清培養(yǎng)基促進(jìn)DNA與陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的形成，提高轉(zhuǎn)染效率。

有了轉(zhuǎn)染復(fù)合物，含shRNA、包裝質(zhì)粒和脂質(zhì)體，就可以進(jìn)行包裝了。傾斜帶有HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)皿，將轉(zhuǎn)染混合物逐漸加入收集的培養(yǎng)基中。

在添加轉(zhuǎn)染混合物時(shí)要謹(jǐn)慎，溫柔操作。一旦加入溶液，小心地旋轉(zhuǎn)平板，使培養(yǎng)基混合，將轉(zhuǎn)染混合物均勻地分配到細(xì)胞上。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-8小時(shí)。

孵育后，輕輕抽吸培養(yǎng)基(這將包含沒有轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的含有質(zhì)粒的脂質(zhì)體)，并在培養(yǎng)皿的一側(cè)加入10 ml完全培養(yǎng)基，這樣細(xì)胞就不會(huì)分離。HEK293細(xì)胞將shRNA包裹成病毒顆粒并釋放到培養(yǎng)基中。 

此時(shí)，培養(yǎng)基中會(huì)充滿病毒顆粒，因此在搬運(yùn)時(shí)應(yīng)穿戴適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)用品。

48小時(shí)后收集培養(yǎng)基(病毒顆粒)，將10 ml新鮮的完全培養(yǎng)基加入同一培養(yǎng)皿中。72小時(shí)后再次收集培養(yǎng)基，與48小時(shí)收集的結(jié)合。

通過0.45微米的過濾器對收集到的混合培養(yǎng)基進(jìn)行消毒，以允許病毒通過。凍融循環(huán)會(huì)降低病毒的效力，所以最好進(jìn)行分裝。

病毒可以在4℃下保存一到兩個(gè)月，長期保存在-20℃。經(jīng)常使用漂白劑處理在病毒產(chǎn)生過程中使用的吸管頭和平板。

 

 病毒進(jìn)入細(xì)胞

通常，測定病毒的效價(jià)非常重要，方便確定實(shí)驗(yàn)濃度。一個(gè)良好的敲除，至少50%的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒。用適當(dāng)?shù)姆治龇椒z查細(xì)胞是否定點(diǎn)敲除，通常涉及到Western Blot。

1.使用相同比例的病毒和細(xì)胞獲得50%的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)15ml的試管中，用5ml的完全培養(yǎng)基重懸約200萬個(gè)細(xì)胞（10cm培養(yǎng)皿的四分之一）。

 

 

在同一試管中，加入2.5ml病毒和15ug/ml的聚凝胺。聚凝胺通過中和病毒顆粒和細(xì)胞膜之間的電荷來提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

 

 

 

2.輕輕混勻，將細(xì)胞放入一個(gè)10cm的新培養(yǎng)皿中。24小時(shí)后，換到?jīng)]有病毒的新鮮完全培養(yǎng)基中。

 

 

如果shRNA構(gòu)建物含有熒光標(biāo)記物，可以檢測轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測是否整合成功；如果沒有，繼續(xù)進(jìn)行抗生素選擇48小時(shí)。