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一.ELISA標準操作要點
優質的試劑良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件ELISA中用的蒸餾水或去離子水包括用于洗滌的應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm 1.標本的采取和保存 大部分ELISA檢測均以血清為標本血清標本可按常規方法采集應注意避免溶血紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質以HRP為標記的ELISA測定中溶血標本可能會增加非特異性顯色血清標本宜在新鮮時檢測如有細菌污染菌體中可能含有內源性HRP也會產生假陽性反應一般說來在5天內測定的血清標本可放置于4℃標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合使間接法的試劑本底加深超過一周測定的需－20℃保存凍結血清融解后蛋白質局部濃縮分布不均應充分混勻并避免產生氣泡混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾澄清后再檢測反復凍融會使抗體效價跌落所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測宜少量分裝冰存保存血清自采集時就應注意無菌操作也可加入適當防腐劑. 抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑. 2.加樣 加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部避免加在孔壁上部并注意不可濺出. 3.保溫 在建立ELISA方法作反應動力學研究時實驗表明兩次抗原抗體反應一般在37℃經 1-2小時產物的生成可達頂峰為避免蒸發板上應加蓋也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔反應板不宜疊放以保證各板的溫度都能迅速平衡應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成采用水浴會造成值偏高或花板另外溫育中還有邊緣效應邊上的值會偏高建議為了客觀的判斷結果將質控放在非邊緣位置. 4.洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟但卻決定著實驗的成敗ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來可以說在ELISA操作中洗滌是最主要的關鍵技術應引起操作者的高度重視操作者應嚴格按要求洗滌不得馬虎. 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的非離子型洗滌劑既含疏水基團也含親水基團其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合從而削弱蛋白質與固相載體的結合并借助于親水基團和水分子的結合作用使蛋白質回復到水溶液狀態從而脫離固相載體洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20其濃度可在0.05%-0.2%之間高于0.2%時可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度 洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用如果洗液需要稀釋應按要求稀釋所用的水電導率最好在1.5us/cm之下洗液如果結晶應待其融解后配制保證洗板浸泡時間為40秒左右孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡. 5.顯色和比色 TMB經HRP作用后約40分鐘顯色達頂峰隨即逐漸減弱至2小時后即可完全消退至無色TMB的終止液有多種疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪是目視判斷的良好終止劑此外各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值酶標比色儀簡稱酶標儀通常指專用于測讀ELISA結果吸光度的光度計酶標儀的主要性能指標有：測讀速度讀數的準確性重復性精確度和可測范圍線性等等優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001準確性為±1%重復性達0.5%酶標儀不應安置在陽光或強光照射下操作時室溫宜在15~30℃使用前先預熱儀器15-30分鐘測讀結果更穩定 測讀A值時要選用產物的敏感吸收峰如OPD用492nm波長有的酶標儀可用雙波長式測讀即每孔先后測讀兩次第一次在最適波長（W1）第二次在不敏感波長（W2）兩次測定間不 移動ELISA板的位置最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾. 二.本底及假陽性產生的原因分析
1.基因工程抗原與合成肽抗原的區別 1.1基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統該類抗原與合成肽相比具有以下特點： a.分子量大合成肽采用化學方法制備由于工藝的局限合成數量有限只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原分子量更大 b.穩定性好包被的抗原的穩定性可使試劑盒的效期得到保證早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個月采用基因工程抗原后效期大大延長了 c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達表達產物包含更多的抗原決定簇可提高試劑盒的靈敏度提高檢出率 d.純化難度大基因工程抗原的純化技術難度較大 1.2合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段合成肽抗原有以下特點： a.分子量太小 b.一般只含有一個抗原決定簇 c.純度高 d.穩定性差 由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優越性ELISA診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡就HCV ELISA試劑盒來講第一代產品為合成肽抗原主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽只是當時的基因工程抗原不全僅包括了HCV的核心區片段；第三代產品基本上采用了基因工程抗原而且這些抗原包括更多更穩定純度更高的HCV特異性抗原第三代試劑的敏感度大大提高了 由于歷史的原因人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA反應試劑盒因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被該類試劑盒的流行病學敏感度不夠穩定性也成問題值得欣慰的是也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度科學得對待反應結果 2．假陽性本底產生的原因 2. 1抗原因素 2.1. 1融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為例為例因為包被的基因工程抗原為融合蛋白包含了來自表達載體的一些序列因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發生反應而產生了可疑標本. 摘自《檢驗醫學在線》 |
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