細菌內毒素檢查法替代生物材料和醫療器械熱原檢查的近況
陳丹丹 黃清泉 王春仁 奚廷斐 來源：實驗動物科學與管理 廈門鱟試劑廠錄入
中國藥品生物制品檢定所 北京 100050
關鍵詞:細菌內毒素；熱原檢查；生物材料；醫療器械
1 概述
生物材料和醫療器械是指用于診斷和治療的介入和植入人體的材料和器械。生物材料和醫療器械是近30年來發展起來的新興學科，目前己經在臨床廣泛應用。如何保證生物材料和醫療器械的安全性問題越來越受到各國政府和學術界的重視。在生物材料和醫療器械的安全性評價中，熱原檢查無疑是重要的內容之一。
1942年熱原檢查法首次收載于美國藥典12版(USP XⅡ)。隨后世界各國藥典相繼收載了這一方法，半個多世紀以來該方法一直作為法定的熱原檢查法為各國藥典所采用。
各國藥典收載的熱原檢查方法基木相同。該法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定的時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判斷供試品中所含熱原的限度是否符合規定的一種方法。直至目前，各國藥典確認的熱原檢查法仍系沿用60年前建立起來的家兔升溫試驗。
由于家兔法本身存在的局限性，人們一直試圖尋找一些新的方法替代或補充。因為家兔法雖然能直觀地反映各種熱原的致熱程度，但不易標準化、不能定量、重現性差、靈敏度不如鱟試驗高、受某些藥品木身的藥理活性及理化性質的影響較大、費用高、費時、結果與家兔的品系和飼養條件有關、涉及使用動物等。目前己經成熟的熱原檢查的替代方法是細菌內毒素檢查法。
細菌內毒素檢查法(Bacterial Endotoxins Test, BET)自1968年由美國學者Bang和Levin正式建立(該法又稱作鱟試驗，即Limulus Test)至今，經過二十多年的不斷完善和發展，現巳在醫藥衛生、環境保護等方面發揮著極其重要的作用。
細菌內毒素檢查法在藥品檢驗中的應用是從放射性藥品和注射用水開始的。1980年USP20版首次收載細菌內毒素檢查法，1983年UPS20第四增補本規定5種水和40種放射性藥品采用細菌內毒素檢查法代替熱原檢查法。1991年，U SP22版第五增補木又規定185種藥品采用細菌內毒素檢查法代替熱原檢查法。1995年，UPS23規定471種藥品進行細菌內毒素檢查，保留熱原檢查的品種不足40種。美國藥典24版共收載579種藥品進行細菌內毒素檢查。
對于那些直接或間接與心血管系統或軟體組織接觸的標有無熱原字樣的生物材料和醫療器械來說，進行熱原檢查是必須的。美國藥典中收載的進行細菌內毒素檢查的品種如下:液體給藥設備，延伸設備，傳輸設備，血液給藥設備，靜脈內導管，植入的體外氧氣導管和附件，透析器，透析管和附件，血管移植物，心瓣膜，肌肉內藥物傳送管和輸液(血)器等。（廈門鱟試劑廠錄入）
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2 現在已經采用細菌內毒素檢查法替代熱原檢查法的品種
我們統計了我們工作中己經采用內毒素檢查法的品種共有35種，具體如下，這是一個不完全的統計，因為還有其它我們沒有涉及的品種。
它們是:眼科用粘彈劑、人工晶體、下腔靜脈濾器、必施無菌灌注液、疝修補網織片、體內埋植泵、冠脈支架系統、一次性使用無菌穿刺針、膽道球囊導管、一次性血液管理套件、眼科用重水、硅油、腎動脈支架、膜式氧合器、一次性輸液器、一次性注射器、JRS系列自彈式血管內支架及輸送系統、JRZ系列不銹鋼z型支架及輸送系統、JRN系列鎳欽形狀記憶合金支架及輸送系統、CLIN1 MACS管道系統、巴德LU MINEXX支架放置系統、眼內灌注用平衡鹽溶液,CLINIMACS CD34細胞分選試劑、頸動脈轉流管、靜脈導管套件盒及附件、眼用透明質酸鈉、海藻酸鈉微球血管栓塞劑一次性使用麻醉穿刺包、張力環、青光眼引流器、輸精管濾過裝置、外科種植體、組織固定系統、血管移植物、生物陶瓷義眼臺、器官保存液等。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
3 仍然采用熱原檢查法的品種（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
根據我們工作中的品種進行統計，仍有18種采用熱原檢查法，即家兔法。它們是:止血膠原海綿、醫用即溶止血紗布、一次性活檢裝置、一次性使用輸血泵、心臟瓣膜、尼龍眼科帶針縫合線、一次性使用中心靜脈導管，PGA可吸收縫合線、人工骨粒、生物衍生骨、外科修補材料、水凝膠乳房植入體、一次性使用創傷手術縫合包、鹽水乳房假體、硅凝膠乳房假體、可吸收椎間融合器、聚丙烯粒料、離心泵泵頭等。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
4 采用細菌內毒素檢查法替代家兔法的優缺點（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
優點:方便、快捷、經濟:缺點:干擾作用、回收率低。
5 應用
生物材料和醫療器械的熱原檢查用細菌內毒素檢查法來替代是大勢所趨，相信隨著細菌內毒素檢查法的廣泛應用，越來越多品種的熱原檢查將會被鱟試驗法所取代。同時這也是動物保護的一個重要內容。自1959年W. M. S.Russell(動物學家)和 R. L. Burch(微安全性家)發表《仁慈試驗技術原理》(The Principles of Humane Experirrrental Technique) 一書以來，以減少(Reduction)、優化(Refinement) 和替代(Replacement)為核心的動物試驗替代方法的3R理論己經被愈來愈多的的科學家所接受，并在實際研究工作中得到了廣泛的應用，對推動生命科學以及相關學科研究的發展起到了重要作用。到目前為止，一個定期連續召開的世界性學術會議--動物試驗替代方法世界大會己經召開了二次:1993年在美國的巴爾的摩( Baltimore) , 1996年在荷蘭的烏特勒支(Utrecht) , 1999年在意大利的波倫那(Bologna) 。第四次于2002年8月在美國的新奧爾良(New Orleans)召開.
此外，除了用細菌內毒素試驗替代熱原試驗外，目前很多學者正在研究用人的血液THP-1和MM6細胞系檢測熱原。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
目前存在的問題是標準、方法不規范和統一。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
發布時間：2008-12-30
醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 （內毒素部分）GBT14233.2-2005
GBT14233.2-2005-醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第二部分：生物試驗方法（內毒素部分）
GB/T 14233.2-2005
4 細菌內毒素試驗
4.1 目的
本試驗為《中國藥典（二部）》附錄“細菌內毒素檢查法”中規定的“凝膠法”，系利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的機理，以判定供試品中內毒素的限量是否符合規定。
如經檢驗證實供試品對細菌內毒素試驗有不能排除的干擾作用則不適宜采用本試驗。
4.2 試劑
細菌內毒素國家標準品、細菌內毒素工作標準品、鱟試劑、細菌內毒素檢查用水。
注：細菌內毒素檢查用水系指符合《中國藥典（二部）》附錄中“細菌內毒素檢查法”規定的滅菌注射用水。
4.3 主要設備
超凈工作臺、恒溫培養箱、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、旋渦混合器。
4.4 試驗前準備
4.4.1 器具處理
試驗所用器皿需經處理除去可能存在的外源性內毒素。玻璃器皿置電熱干燥箱內180℃干烤至少2h，或250℃干烤至少30min，塑料器皿置30％雙氧水中浸泡4h，再用細菌內毒素檢查用水充分沖洗后置60℃烘干備用。
4.4.2 鱟試劑靈敏度復核試驗
4.4.2.1 當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。
4.4.2.2 試驗步驟按《中國藥典（二部）》附錄“細菌內毒素檢查法”中規定進行。
見http://www.houshiji.com/newslist.asp?newsid=135
4.4.3 供試品干擾試驗
4.4.3.1 對未知或可疑的供試品初次進行細菌內毒素試驗之前應先進行干擾試驗，以檢驗供試品對細菌內毒素試驗是否有抑制或增強作用，以及其他影響細菌內毒素試驗準確性和敏感性的干擾作用。當鱟試劑、供試品來源、供試品配方或生產工藝有變化或其他任何可能影響細菌內毒素試驗結果的試驗條件改變時，應重新進行干擾試驗。
4.4.3.2 每種醫療器械產品應取3批并分別使用不少于兩個制造商生產的鱟試劑進行干擾試驗。供試液制備按4.5.3規定進行。
4.4.3.3 試驗步驟按《中國藥典（二部）》附錄“細菌內毒素檢查法”中“凝膠法”規定進行。
4.4.3.4 供試品對細菌內毒素試驗有干擾作用，可選用下列適宜方法排除干擾：
a) 使用更靈敏的鱟試劑對供試液進行更大倍數稀釋；
b) 采用無熱原氨基甲烷緩沖液稀釋供試液；
c) 采用無熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液調節供試液PH值在6.0~8.0范圍內；
d) 采用陽離子緩沖液（MgSO4或MgCl2）稀釋供試液以調節離子濃度。
4.5 試驗方法
4.5.1 供試品數量
同一批號至少3個單位供試品。
4.5.2 浸提介質
細菌內毒素檢查用水
4.5.3 供試液制備
根據產品標準規定的細菌內毒素限值確定浸提介質體積，選用下列適宜方法制備供試液：
a) 管類和容器類器具用細菌內毒素檢查用水浸泡器具內腔，在（37±1）℃恒溫箱中浸提不少于1h；
b) 小型配件或實體類器具置無熱原玻璃器皿內，加入細菌內毒素檢查用水振搖數次，在
（37±1）℃恒溫箱中浸泡不少于1h。
供試液貯存應不超過2 h。
注1：浸提介質體積計算公式：V=L/λ
式中：
V——浸提介質體積，單位為毫升（mL）；
L——產品細菌內毒素限值，單位為細菌內毒素單位每件（EU/件）；
λ——所用鱟試劑靈敏度標示值，單位為細菌內毒素單位每毫升（EU/mL）。
注2：輸液、輸血、注射器具細菌內毒素限值在產品標準中規定，宜盡可能低。推薦輸液、輸血、
注射器具細菌內毒素限量每件不超過20EU，與腦脊液接觸和胸內應用醫療器械每件不超過2.15EU。
4．5．4 試驗步驟和結果判定
按《中國藥典（二部）》附錄“細菌內毒素檢查法”中“凝膠法”規定進行。
4．5．5 試驗報告
試驗報告中宜給出下列信息：
a)供試品名稱；
b)生產批號；
c)供試液制備方法；
d)細菌內毒素限量；
e)結果判定。
--------節選自 《GBT14233.2-2005-醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法》
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2008年11月 |
