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1968年美國科學家Dr. Levin和Bang建立了鱟試驗法。此后世界各國對鱟試劑的生產和應用得以迅速發展。1980年美國藥典20版首先收載了細菌內毒素檢 查法。隨后，英國藥典、日本藥局方、中國藥典等也相繼收載了該方法。本文主要對中國藥典1995年版與英國藥典1995年增補本、美國藥典23版和日本藥局方13版等的細菌內毒素檢查法進行了比較。 1 檢驗品種的比較 中國藥典1995年版二部共收載細菌內毒素檢查品種12個，2000年版二部增至47個，而美國藥典23版收載了471個品種進行細菌內毒素檢查。因此，我們需加緊對更多的品種進行細菌內毒素檢查方法的研究，加快該法對藥品檢驗的普及和推廣工作，提高我國藥品標準和檢驗水平。 2 檢驗方法的比較 細菌內毒素試驗的方法有凝膠法、濁度法、顯色基質法、免疫學法等。其中凝膠法多為限量 檢查法，濁度法和顯色基質法為定量檢查法，且后兩種方法都屬于分光光度法。濁度法還可 分為終點濁度法和動態濁度法；顯色基質法也可分為終點顯色基質法和動態顯色基質法。 凝膠法是較為經典的方法，各國藥典都有收載，而收載了細菌內毒素定量測定法的有美國藥典、英國藥典、歐洲藥典和日本藥局方等。中國藥典1995年版只收載了凝膠法，2000年版才涉及到定量測定法。因此，我們還需要對細菌內毒素定量測定進行研究，需要有供定量測定 用的標準品、儀器和試劑，以后逐步建立起我國的細菌內毒素定量測定方法。 3 細菌內毒素標準品 各國藥典均設置了細菌內毒素的標準品，其中中國藥典、英國藥典和美國藥典還可采用根據標準品為基準進行標定的工作標準品或對照標準品。除英國藥典采用U為內毒素的單位外，其余各國藥典都用EU為內毒素的單位。 美國藥典和中國藥典對內毒素標準品每一步稀釋時的混勻時間作出了明確規定。除中國藥典外，其余各國藥典規定了內毒素標準貯備液在冰箱里保存不得超過14d，且用前應在旋渦混 合器上充分混合至少3min。 4 細菌內毒素檢查用水 細菌內毒素檢查用水系指與使用批號鱟試劑在一定時間內不產生凝集反應的注射用水。在英國藥典中，不允許用家兔熱原試驗的技術檢查細菌內毒素檢查用水是否含內毒素。 5 試驗準備 由于內毒素能吸附在塑料或玻璃制的小管或吸管表面，塑料材料也可能釋放干擾物質，因此英國藥典要求檢查所用的材料，并建議檢驗者在更換新批號的材料時要重新檢查。 在英國藥典中沒具體指明除去外源性內毒素的方法，而在中國藥典和日本藥局方中明確指出 所用容器或器皿要在250℃條件下干烤至少1h。美國藥典也采用高溫烘烤法除去外源性內毒素。無論使用什么材料，什么方法，都應確認在試驗中沒有可被檢測的外源性內毒素和(或)干擾作用。 6 限量法的檢查 6.1 鱟試劑靈敏度復核 鱟試劑靈敏度的復核主要是用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素標準品制備成4個連續的2倍稀釋的系列溶液，即2λ(λ為鱟試劑靈敏度)、λ、0.5λ和0.25λ，然后按細菌內毒素檢 查法下操作，最后根據試驗結果，計算出每一系列稀釋液出現陽性結果的最低濃度對數平均值，該平均值的反對數即為鱟試劑的靈敏度測定值。 除日本藥局方外，英國藥典和美國藥典均要求在做鱟試劑靈敏度復核時要設置陰性對照。中國藥典1995年版的1998年增補本中也增加了這一要求。有了陰性對照，才能證實鱟試劑及細 菌內毒素檢查用水中沒有可測出的內毒素，使試驗更具科學性和可靠性。 對4個連續的2倍稀釋的系列溶液的檢出結果，美國藥典未做說明，中國藥典則要求最高濃度4管均為陽性，最低濃度4管均為陰性，而英國藥典和日本藥局方只要求最低濃度的結果為陰性。 此外，中國藥典和美國藥典要求靈敏度測定值在0.5λ～2.0λ之間，且包括0.5λ和2.0λ，英國藥典和日本藥局方則未對是否包括0.5λ和2.0λ做出說明。 6.2 供試品干擾試驗 供試品干擾試驗與鱟試劑靈敏度復核試驗最大的不同點在于溶解內毒素標準品的溶劑除了用細菌內毒素檢查用水外，還要用未檢出內毒素的供試品溶液或不超過最大有效稀釋倍數(MVD)的稀釋液，其余操作和結果計算則大體相同。僅有英國藥典未要求用細菌內毒素檢查用水 與供試品一同對照，用上述供試品稀釋內毒素標準品即可。 在英國藥典中排除干擾的方法有稀釋、過濾、中和、透析，或加入幾種不吸附內毒素，使用更靈敏的鱟試劑等，且要求在干擾排除后，要在供試品中加入內毒素標準品后重復干擾試驗，以驗證所選處理方法能有效排除干擾而不影響內毒素的測定。而在其他幾部藥典中提到的方法較少一些。 6.3 檢查法 在做供試品細菌內毒素檢查時，需設置陰性對照、陽性對照和樣品陽性對照。美國藥典、英國藥典和日本藥局方對樣品陽性對照都有規定，中國藥典是在1995年版的1998年增補本中增加這一項目的。因樣品陽性對照可證明在試驗條件下被檢查的供試品溶液中不存在干擾作用 。 在英國藥典中還提出，如有必要，可使用0.1 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液或一種合適 的緩沖液調節供試品pH值，使其pH值在6.5~7.5之間。美國藥典和日本藥局方也有類似的要求，中國藥典目前還沒嚴格要求混合物的pH值。由于混合物的pH值在6.5~7.5之間時，細菌內毒素產生最佳凝結，所以對混合物的pH值做出限定還是有必要的。 6.4 結果判斷 幾部藥典都要求當設置的陽性對照、供試品陽性對照為陽性，陰性對照為陰性，試驗才有效 。供試品管均為陰性則認為符合規定；若為陽性則不符合規定；如一管為陰性，一管為陽性則需復試。 7 定量法的檢查 美國藥典和英國藥典沒有制定出細菌內毒素定量檢查法的具體操作，但需要證明該法中的標 準曲線符合直線回歸要求，對終點法還要求其截距應近似為零，然后通過內推法確定被測物 質的內毒素含量。 在日本藥局方中收載了兩種細菌內毒素定量測定法。第一種是凝膠法，該法要求用細菌內毒 素檢查用水將供試品和內毒素分別稀釋為4個濃度，供試品的稀釋倍數分別為1、2、4、8倍 ，內毒素濃度則分別為2λ、λ、0.5λ和0.25λ，每個濃度均做2管，同時設置陰性對照和陽性對照，按檢查法操作。對于供試品稀釋液，先計算出溶液的終點濃度，以每一終點對應的稀釋倍數(以十進位小數表示)乘以λ，供試品溶液中內毒素的濃度則通過計算供試品溶液稀釋后測得的終點濃度的幾何平均值獲得。 第二種光度法需要進行標準曲線的可靠性試驗和用供試品溶液進行的抑制或增強試驗。然后按檢查法做2管供試品管，同時制備標準曲線(即陽性對照)，設置陰性對照和樣品陽性對照。其中樣品陽性對照的內毒素濃度為標準曲線中的最高濃度和最低濃度的中間值。供試品內毒素濃度可用陽性對照組產生的回歸曲線計算。 在細菌內毒素定量檢查法中采用的鱟試劑，生物特異性好，標準化程度高，操作簡單，成本低廉，使得這一方法越來越得到普遍的應用。 通過對各國藥典中細菌內毒素檢查法的比較，可以看出中國藥典在此法上已做了很大的改進，但還存在一定的差距。我們相信更規范、更科學、更先進的中國藥典細菌內毒素檢查法終將出臺，繼續指導我們對藥品的質量監督，發揮出更大的作用。
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