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HPV16型早期蛋白基因后端粒酶的活性表達(dá)
第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999年第19卷第5期
人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染
吳 翔 朱 冰 楊光彩 徐 鈐
摘 要 用已構(gòu)建的含有HPV16的早期蛋白的質(zhì)粒載體：pME6SN、pME7SN和pME6E7SN經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)入正常的人成纖維細(xì)胞。經(jīng)G418選擇篩選及鑒定后證實(shí)，E6、E7、E6E7轉(zhuǎn)化的細(xì)胞壽命延長(zhǎng)；E6、E6E7表達(dá)的細(xì)胞中有端粒酶的表達(dá)，E7表達(dá)的細(xì)胞中未能檢測(cè)到端粒酶的表達(dá)。提示端粒酶的表達(dá)是細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的一個(gè)后續(xù)事件。
關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒 E6 E7 人成纖維細(xì)胞 端粒酶
自70年代末以來(lái)，不斷增加的流行病學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)的證據(jù)表明：人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）與宮頸癌的關(guān)系非常密切。宮頸癌及其癌株細(xì)胞（Hela）中可檢測(cè)到特異性的HPV早期蛋白，而其中有些蛋白（如HPV16E6、E7蛋白）的編碼基因被證實(shí)為轉(zhuǎn)化基因。1996年，Klingelhutz[1]等用人乳頭瘤病毒的E6、E7、E6E7基因轉(zhuǎn)入正常人角質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)生存代數(shù)延長(zhǎng)和永生化現(xiàn)象，證實(shí)當(dāng)時(shí)細(xì)胞永生化與端粒酶的表達(dá)有關(guān)。1997年，Shiga[2]將HPV16的E6、E7、E6E7基因轉(zhuǎn)入人成纖維細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)方面的改變，細(xì)胞中出現(xiàn)端粒酶的表達(dá)。
本研究率先在國(guó)內(nèi)用檢測(cè)端粒酶活性表達(dá)的方法進(jìn)一步研究癌基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。通過(guò)研究人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV16E6、E7癌基因?qū)Χ肆Ｃ傅幕钚员磉_(dá)作用，進(jìn)一步研究HPV16E6、E7基因的致癌機(jī)理及其相互關(guān)系，從而為人乳頭瘤病毒的早期診斷和治療探討新的手段和途徑。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1材料
1.1.1 質(zhì)粒 pMSN重組質(zhì)粒由pMDSG質(zhì)粒改造構(gòu)建而成。在pMSN的Xba1位點(diǎn)分別插入HPV16E6、E7和E6E7基因，所得重組質(zhì)粒分別稱為pME6SN，pME7SN和pME6E7SN，由德國(guó)de Villiers博士惠贈(zèng)，本室保存。
1.1.2引物 CX、TS、P1、P2、P3、P4、P5、P6，由中科院上海植物生理所植物分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成（表1）。
表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物
Tab. 1 Primers in assay
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Name
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Sequence
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Usage
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CX
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5’CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA3’ |
Amply telomerase |
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TS
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5’AATCCGTCGAGCAGAGTT3’ |
Amply telomerase |
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P1
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5’TTAGAACAGCAATACAACAAAC |
Amply E6 fragment |
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P2
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5’ACCGGTCCACCGACCCCTTA |
Amply E6 fragment |
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P3
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5’TAGAGTCACACTTGCAACAA |
Amply E7 fragment |
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P4
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5’GAGACAACTGATCTCTACTG |
Amply E7 fragment |
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P5
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5’TTAGAACAGCAATACAACAAAC |
Amply E6E7 fragment |
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P6
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5’TAGAGTCACACTTGCAACAA |
Amply E6E7 fragment |
1.1.3 研究對(duì)象 人成纖維細(xì)胞（Normal human fibroblast, NHF）
1.2 主要試劑
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，LIPOFECTAMINE( Gibco BRL公司)，G418( Gibco BRL公司)。
1.2.2 提細(xì)胞DNA裂解液 廣州達(dá)安醫(yī)學(xué)診斷公司。
1.2.3 TRAP法中使用的細(xì)胞裂解工作液I （4℃保存） 10 mol/L Hepes-KOH，1.5 mol/L MgCl2，10 mol/L KCl，1 mol/L DTT。
1.2.4 TRAP法中使用的細(xì)胞裂解工作液II（4℃保存） 10 mol/L Tris-HCl (pH7.5)，1 mol/L MgCl2，1 mol/L EGTA，0.1 mol/L AEBSF，0.55%CHAPS，5 mol/L b -巰基乙醇，10%甘油。
1.2.5 酶轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液成分 20 mol/L Tris-Cl(pH8.3)，1.5 mol/L MgCl2，63 mol/L KCl，0.005% Tween-20， 1 mol/L EGTA，50 μmol/L dNTP，1μg T4g32蛋白。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1細(xì)胞培養(yǎng)及收獲
2.1.1 人成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 取傳代培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞，棄去瓶中的培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化。按1:3的比例傳代。置37℃，5%CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，建立皮膚組織成纖維細(xì)胞的傳代體系。
2.1.2 培養(yǎng)細(xì)胞的收獲 若需收集細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)入離心管中，8 000 g%26acute; 10 min，室溫離心，收集細(xì)胞團(tuán)塊。
2.2 HPV16的早期蛋白基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞 參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]及GIBCO公司Lipofectamin試劑產(chǎn)品說(shuō)明書上的方法進(jìn)行，傳第3代（1～2）%26acute; 105個(gè)細(xì)胞到60 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)。約2周后，可見(jiàn)有抗性克隆形成，待其逐漸長(zhǎng)大，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶后，采用刮除法以獲得純的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群。
2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定 取滅菌的0.5 ml離心管一個(gè)，PCR反應(yīng)總體積為50μl，收獲培養(yǎng)的細(xì)胞加入提細(xì)胞DNA裂解液，100℃水浴處理10 min，1 000 g×10 min離心后取上清作為反應(yīng)模板。加50 pmol/L的引物P5-P10(引物配對(duì)方式見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料1.1.2部分，分別擴(kuò)增E6，E7，E6E7片段)各2μl，模板0.5μg等反應(yīng)液，混勻后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5μl反應(yīng)液，在8%的聚丙烯酰胺凝膠上穩(wěn)壓150 V電泳2 h，銀染。
2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)化后端粒酶活性的測(cè)定
2.4.1 細(xì)胞中端粒酶的提取，表達(dá)水平的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[4]的TRAP方法
2.4.2 非放射性銀染技術(shù)對(duì)TRAP產(chǎn)物進(jìn)行觀察
2.4.2.1電泳 取TRAP產(chǎn)物30 m l及標(biāo)準(zhǔn)分子量（PBR322DNA/HaeIII）1 m g，分別與適量加樣緩沖液混合上樣進(jìn)行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓200 V，恒壓電泳4 h。
2.4.2.2銀染 取下凝膠，置10%乙醇內(nèi)固定10 min，水洗2次；1%硝酸內(nèi)脫色3 min，水洗2次；0.012 mol/L硝酸銀染色液避光染色20 min，水洗3次；0.28 mol/L Na2CO3-0.019%甲醛顯影液，直至產(chǎn)物信號(hào)足夠強(qiáng)而背景不致過(guò)高為止；用10%的冰醋酸終止反應(yīng)，水漂洗后制干膠保存或拍照。
2.4.2.2 對(duì)圖象進(jìn)行計(jì)算機(jī)掃描分析 將染好的膠置于凝膠圖象分析系統(tǒng)拍照。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆及篩選 正常人成纖維細(xì)胞（圖1-A）伸展良好，折光性較弱，單層生長(zhǎng)，有方向性和接觸抑制作用。在含G418 (400 mg/L)的培養(yǎng)液中，第3 天開(kāi)始死亡（圖1-B），而由質(zhì)粒r MSN重組系列轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞經(jīng)G418(400 mg/L)篩選培養(yǎng)2周后，逐漸形成大小不等的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶（圖2）。
圖1 正常傳代培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞(A)及加入G418后的正常人成維細(xì)胞(B)
Fig. 1 Normal NHF (A) and normal NHF added with G418(B)
a: Primary cells at passage (P) 3，characterized by stretching well, growth with direction and contact-inhibition; B: Primary cells were introduced by blank vectors, All of them died after 5 days with G418 400 mg/L ×100
圖2 pME6SN、pME7SN、pME6E7SN轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞2周后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶
Fig. 2 NHFs introduced by pME6SN, pME7SN, pME6E7SN
producing transfected clone after 2 weeks ×100
經(jīng)pME6SN、pME7SN、pME6E7SN轉(zhuǎn)化的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞大小不一，生長(zhǎng)方向紊亂，接觸抑制消失，呈重疊性生長(zhǎng)，伸展性較差，折光性強(qiáng)，形態(tài)類似于上皮細(xì)胞等惡性細(xì)胞表型特征。而不含HPV任何基因的空載體r MSN轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，具有接觸抑制作用，有方向性單層、不重疊生長(zhǎng)，其細(xì)胞特征與正常人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)相似。
3.2轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定結(jié)果 所設(shè)計(jì)的3對(duì)引物分別對(duì)HPV的E6、E7、E6E7基因是特異的，擴(kuò)增后的片段為140、138和387 bp，與預(yù)期的結(jié)果完全一致（圖3）。
圖3 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定
Fig. 3 Identification of cells transformed by PCR, 8% non-denaturing PAGE ,150 V for 2 hours and silver-staining
1: NHF introduced by pME6E7SN; 2: NHF introduced by pME7SN; 3: NHF introduced by pME6SN; M: marker
3.3 人成纖維細(xì)胞經(jīng)HPV16早期蛋白基因轉(zhuǎn)染后檢測(cè)端粒酶活性 從不同細(xì)胞端粒酶表達(dá)的時(shí)間先后來(lái)看，HPV16E6基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后的第15代（從細(xì)胞原代培養(yǎng)開(kāi)始計(jì)算生存代數(shù)，下同）出現(xiàn)端粒酶的表達(dá)；HPV16E7基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后直至細(xì)胞死亡（第19代），一直未檢測(cè)到端粒酶的表達(dá)；HPV16E6E7基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后的第14代即可檢測(cè)到端粒酶的表達(dá)；而正常細(xì)胞和經(jīng)pMSN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞只能生長(zhǎng)至第10代和第13代，未檢測(cè)到端粒酶的表達(dá)（圖4）。
圖4 pMSN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后端粒酶的表達(dá)情況
Fig.4 Telomerase activities of NHFs transfected by pMSN recombinant plasmids were analyzed by TRAP method
1: NHF; 3: NHF introduced by pMSN; 5: NHF introduced by pME6SN; 7: NHF introduced by pME7SN; 9: NHF introduced by pME6E7SN; 11: Hela cell; 2,4,6,8,10,12: cell extracts pretreated at 100℃ for 10 min; 13: marker (pBR322DNA/HaeIII)
4 討論
細(xì)胞經(jīng)pMSN、pME6SN、pME7SN、pME6E7SN質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后，僅在pME6SN、pME6E7SN 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞檢測(cè)出端粒酶的表達(dá)，而在pMSN、pME7SN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未能檢測(cè)出端粒酶的表達(dá)。HPV16E6E7基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中端粒酶出現(xiàn)最早，在轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞生長(zhǎng)的第14代即有檢出信號(hào)，HPV16E6基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞要到細(xì)胞生長(zhǎng)的第15代才有檢出信號(hào)。這與Klingelhutz[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，Klingelhutz認(rèn)為細(xì)胞轉(zhuǎn)入HPV16基因后早期就有端粒酶的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)E6，E6E7基因可致使細(xì)胞表達(dá)端粒酶，E7基因不能激活端粒酶的表達(dá)，但細(xì)胞依然出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)變特性。這與Stoppler[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。
由HPV16E7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在每代生長(zhǎng)時(shí)，都檢測(cè)了端粒酶的活性，但一直未發(fā)現(xiàn)端粒酶出現(xiàn)活性，在細(xì)胞正常傳代的第19代出現(xiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象，無(wú)法繼續(xù)傳代而死亡。正常細(xì)胞及經(jīng)空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代至第10代和第13代死亡。
這些時(shí)間數(shù)據(jù)同時(shí)也說(shuō)明，人成纖維細(xì)胞經(jīng)E6、E7、E6E7轉(zhuǎn)染后確實(shí)能延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，細(xì)胞壽命的延長(zhǎng)與端粒酶的表達(dá)可能有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明腫瘤發(fā)生是多因素引起的。
在我們研究的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中E6，E6E7基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可以檢出端粒酶，空質(zhì)粒載體及E7基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不能檢測(cè)到端粒酶。E7基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，雖然我們觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)變化，但端粒酶活性的檢測(cè)結(jié)果始終是陰性，或許E7基因維持細(xì)胞的惡性表型，并不完全依靠端粒酶的表達(dá)，可能還有其他機(jī)制來(lái)維持端粒的長(zhǎng)度，如重組途徑，反轉(zhuǎn)錄途徑或救援途徑[7]。在酵母的研究中已得到證實(shí)[8]。在Kim[4]等人的研究中也發(fā)現(xiàn)雖然多數(shù)腫瘤組織中端粒酶活性很高，但仍有少數(shù)惡性腫瘤不能觀察到該酶的活性，推測(cè)有可能是這些細(xì)胞逃逸了M1期，具有一定的增殖能力，但端粒酶尚未被激活，所以并不能無(wú)限增殖。
可能HPV16E6基因像降解p53一樣，使另一抑癌基因降解而導(dǎo)致端粒酶基因被激活，而不受抑制地表達(dá)，在這一點(diǎn)上E7可能不同，它不能使另一抑癌基因被降解，從而無(wú)法對(duì)端粒酶的表達(dá)出現(xiàn)影響，不顯示出端粒酶的激活表達(dá)，這一推測(cè)有待于在今后的研究工作中進(jìn)一步證實(shí)。
作者簡(jiǎn)介：吳 翔，男，1970年出生；發(fā)表論文兩篇；電話81936697
作者單位：吳 翔 楊光彩 徐 鈐 第一軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)教研室，廣州，510515 朱 冰 兒童醫(yī)院病毒室，廣州，510130
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