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人胚胎干細(xì)胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
（參考冷泉港試驗(yàn)室protocol）
作者：Sohyun L. McElroy1 and Renee A. Reijo Pera
Center for Human Embryonic Stem Cell Research and Education, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University, Palo Alto, CA 94304-5542, USA
通訊作者郵箱： sohyun@stanford.edu 簡(jiǎn)介：
人胚胎肝細(xì)胞(hESCs)具有分化成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層和經(jīng)體外長期培養(yǎng)而不斷增殖的潛能。hESCs有著廣闊的應(yīng)用前景，它能作為“細(xì)胞源”用于新型療法的測(cè)試、藥物篩選和功能基因應(yīng)用等領(lǐng)域；通過利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)或人來源細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，可以維持hESCs未分化狀態(tài)和增殖能力。以下試驗(yàn)方案中，我們描述了應(yīng)用MEF條件培養(yǎng)系統(tǒng)為基質(zhì)進(jìn)行hESCs 無飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法。此方法由于排除了飼養(yǎng)層細(xì)胞帶來的污染問題，適用于hESCs的基因改造（genetic modification）等研究。
實(shí)驗(yàn)材料: 1. 所需試劑（所有溶液均需用0.2-µm過濾器除菌，然后4°C或按特別說明進(jìn)行保存）：
1) bFGF solution (10 µg/mL)
2) Collagenase solution (1 mg/mL)
3) Freezing medium for primary cells
4) Gelatin solution (0.1%, w/v) for MEF
hESCs (cultured in a six-well plate)
Knockout DMEM (Invitrogen 10829-018) (chilled)
5） KSR medium for hESC
6） Matrigel stock solution
MEF feeder cells (irradiated CF1) as prepared in Preparation of Mouse Fibroblast Feeder Cells for Human Embryonic Stem Cell Culture (McElroy and Reijo Pera 2008a)
7） MEF medium for hESC
8） Phosphate-buffered saline (PBS) (1X) (Ca2+/Mg2+-free)
2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1) 離心管 (Falcon) 15mL
2） 10cm培養(yǎng)皿 (optional; see Step 1)
3） 過濾器(0.2-µm)
4） 培養(yǎng)箱（37°C, 5% CO2)
5） 液氮罐
6） 顯微鏡
7） 移液管 (5或10-mL) 或細(xì)胞刮片
8） 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板
實(shí)驗(yàn)操作：
A.條件培養(yǎng)基(CM)的配制
1. 用處理過的MEFs（20,000 cells/cm2 in MEF medium）鋪板/培養(yǎng)皿。請(qǐng)參考Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells (McElroy and Reijo Pera 2008b), 37°C 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
2. 第二天，倒去MEF培養(yǎng)液, 用1X PBS洗板/培養(yǎng)皿兩次；倒去PBS后加入用于hESCs 培養(yǎng)的KSR medium (0.3 mL/cm2).
3. 24小時(shí)后，從培養(yǎng)板/皿中收集條件培養(yǎng)基（CM），加入4 ng/mL bFGF后用0.2-µm 過濾裝置過濾除菌。
說明：條件培養(yǎng)基（未加bFGF）可以保存于–20°C備用。
4. 加入新的KSR medium到鋪有MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的板/皿中, 可每天收集條件培養(yǎng)基。
說明：鋪有MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的板/皿可用于生產(chǎn)條件培養(yǎng)基一周時(shí)間。
B．準(zhǔn)備Matrigel基質(zhì)包被板
5. 把Matrigel stock solution 放于4°C冰上緩慢解凍至少2 h ，以避免形成凍膠。
6. 把Matrigel stock solution與冰冷的knockout DMEM 1:15 混合稀釋成工作液. 6孔板每孔加入1 mL Matrigel工作液進(jìn)行包被.
7. 室溫包被孵育1-2h或4°C包被過夜。
C. hESCs接種基質(zhì)包被板進(jìn)行培養(yǎng)
8. 吸去含有hESC克隆的6孔培養(yǎng)板孔中的培養(yǎng)基.
9. 每孔用2 mL 1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗兩次。
10. 每孔加入 1 mL膠原酶溶液，37°C孵育10-15min。
說明：孵育時(shí)間長短取決于膠原酶的批次和hESC 細(xì)胞系。
11. 在細(xì)胞消化期間，用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗滌Matrigel基質(zhì)包被板兩次，然后每孔加入2mL的條件培養(yǎng)基（步驟3）。
12. 在顯微鏡下檢查hESCs克隆。
說明：hESCs克隆看起來有些皺縮，其邊緣有一定牽扯于板上，而不是完全脫離或漂浮于培養(yǎng)基中。若細(xì)胞克隆脫離，收集培養(yǎng)基并離心收獲細(xì)胞。
13. 移去膠原酶溶液，并用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗板兩次。
14. 每份（split）細(xì)胞加入1 mL條件培養(yǎng)基CM (例如：如果計(jì)劃將細(xì)胞分成3份，則加入3 mL條件培養(yǎng)基).
說明：建議細(xì)胞分割比例為1:1 -1:3,主要取決于ESC克隆細(xì)胞濃度。 15. 小心地用移液管 (5或10-mL) 或細(xì)胞刮片吧細(xì)胞從板孔中刮取下來，轉(zhuǎn)移孔中內(nèi)容物到15-mL 離心管中。
16. 通過小心地吹打成小細(xì)胞團(tuán)（約含50-500 cells ）；請(qǐng)注意不要把細(xì)胞處理成單細(xì)胞懸液。
17. 加入1 mL 包含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基到每孔Matrigel包被板孔中。
18. 把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中；可以通過在水平和垂直方向上傾斜搖勻數(shù)次，使小細(xì)胞團(tuán)分散于培養(yǎng)基中。
19. 每天用2-2.5 mL新的加有4 ng/mL bFGF的條件培養(yǎng)基進(jìn)行營養(yǎng)補(bǔ)給。
20. 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
參考文獻(xiàn)：
1.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008a. Preparation of mouse fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5041
2.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008b. Culturing human embryonic stem cells with mouse embryonic fibroblast feeder cells. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5042.
3.Panula, S. and Reijo Pera, R.A. 2008. Preparation of human foreskin fibroblasts for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5043. |
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