http://www.gducity.com/plus/list.php?tid=79 

Center for Human Embryonic Stem Cell Research and Education, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University, Palo Alto, CA 94304-5542, USA

簡(jiǎn)介：

人胚胎肝細(xì)胞(hESCs)具有分化成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層和經(jīng)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)而不斷增殖的潛能。hESCs有著廣闊的應(yīng)用前景，它能作為“細(xì)胞源”用于新型療法的測(cè)試、藥物篩選和功能基因應(yīng)用等領(lǐng)域；通過(guò)利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)或人來(lái)源細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，可以維持hESCs未分化狀態(tài)和增殖能力。以下試驗(yàn)方案中，我們描述了應(yīng)用MEF條件培養(yǎng)系統(tǒng)為基質(zhì)進(jìn)行hESCs 無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法。此方法由于排除了飼養(yǎng)層細(xì)胞帶來(lái)的污染問(wèn)題，適用于hESCs的基因改造（genetic modification）等研究。

實(shí)驗(yàn)材料:

 

 

1)        bFGF solution (10 µg/mL)

2)        Collagenase solution (1 mg/mL)

3)        Freezing medium for primary cells

4)        Gelatin solution (0.1%, w/v) for MEF

hESCs (cultured in a six-well plate)

Knockout DMEM (Invitrogen 10829-018) (chilled)

5） KSR medium for hESC

6） Matrigel stock solution

MEF feeder cells (irradiated CF1) as prepared in Preparation of Mouse Fibroblast Feeder Cells for Human Embryonic Stem Cell Culture (McElroy and Reijo Pera 2008a)

7） MEF medium for hESC

8） Phosphate-buffered saline (PBS) (1X) (Ca2+/Mg2+-free)

 

1)   離心管 (Falcon) 15mL

2） 10cm培養(yǎng)皿 (optional; see Step 1)

3） 過(guò)濾器(0.2-µm)

4） 培養(yǎng)箱（37°C, 5% CO2)

5） 液氮罐

6） 顯微鏡

7） 移液管 (5或10-mL) 或細(xì)胞刮片

8） 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板

 

 

1. 用處理過(guò)的MEFs（20,000 cells/cm2 in MEF medium）鋪板/培養(yǎng)皿。請(qǐng)參考Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells (McElroy and Reijo Pera 2008b), 37°C 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

2. 第二天，倒去MEF培養(yǎng)液, 用1X PBS洗板/培養(yǎng)皿兩次；倒去PBS后加入用于hESCs 培養(yǎng)的KSR medium (0.3 mL/cm2).

3. 24小時(shí)后，從培養(yǎng)板/皿中收集條件培養(yǎng)基（CM），加入4 ng/mL bFGF后用0.2-µm 過(guò)濾裝置過(guò)濾除菌。

4. 加入新的KSR medium到鋪有MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的板/皿中, 可每天收集條件培養(yǎng)基。

 

5. 把Matrigel stock solution 放于4°C冰上緩慢解凍至少2 h ，以避免形成凍膠。

6. 把Matrigel stock solution與冰冷的knockout DMEM 1:15 混合稀釋成工作液. 6孔板每孔加入1 mL Matrigel工作液進(jìn)行包被.

7. 室溫包被孵育1-2h或4°C包被過(guò)夜。

 

8. 吸去含有hESC克隆的6孔培養(yǎng)板孔中的培養(yǎng)基.

9.  每孔用2 mL 1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗兩次。

10. 每孔加入 1 mL膠原酶溶液，37°C孵育10-15min。

11. 在細(xì)胞消化期間，用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗滌Matrigel基質(zhì)包被板兩次，然后每孔加入2mL的條件培養(yǎng)基（步驟3）。

12. 在顯微鏡下檢查hESCs克隆。

13. 移去膠原酶溶液，并用1X PBS (Ca2+/Mg2+-free)洗板兩次。

14. 每份（split）細(xì)胞加入1 mL條件培養(yǎng)基CM (例如：如果計(jì)劃將細(xì)胞分成3份，則加入3 mL條件培養(yǎng)基).
說(shuō)明：建議細(xì)胞分割比例為1:1 -1:3,主要取決于ESC克隆細(xì)胞濃度。

15. 小心地用移液管 (5或10-mL) 或細(xì)胞刮片吧細(xì)胞從板孔中刮取下來(lái)，轉(zhuǎn)移孔中內(nèi)容物到15-mL 離心管中。

16. 通過(guò)小心地吹打成小細(xì)胞團(tuán)（約含50-500 cells ）；請(qǐng)注意不要把細(xì)胞處理成單細(xì)胞懸液。

17. 加入1 mL 包含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基到每孔Matrigel包被板孔中。

18. 把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中；可以通過(guò)在水平和垂直方向上傾斜搖勻數(shù)次，使小細(xì)胞團(tuán)分散于培養(yǎng)基中。

19. 每天用2-2.5 mL新的加有4 ng/mL bFGF的條件培養(yǎng)基進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給。

20.  當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

 

1.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008a. Preparation of mouse fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5041

2.McElroy, S.L. and Reijo Pera, R.A. 2008b. Culturing human embryonic stem cells with mouse embryonic fibroblast feeder cells. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5042.

3.Panula, S. and Reijo Pera, R.A. 2008. Preparation of human foreskin fibroblasts for human embryonic stem cell culture. CSH Protocols (this issue). doi: 10.1101/pdb.prot5043.