【摘要】 目的 對進行鱟試劑檢測法實驗，建立參麥注射液細菌內素檢測法。方法 按2005年版《中國藥典》所收載的細菌內毒素的檢測方法，進行實驗。用不同廠家的鱟試劑對不同批號的參麥注射液分別進行干擾實驗，考察確立參麥注射液細菌內毒素檢測法。結果 將參麥注射液稀釋60倍以上可消除干擾作用，檢測結果全部為陰性。結果準確可靠。結論 參麥注射液可以用鱟試劑檢查法取代家兔熱源檢查法。
【關鍵詞】 參麥注射液 細菌內毒素 鱟試劑
1 前言
參麥注射液為一種中藥注射劑，其主要成分為中藥紅參與麥冬的有效成分提取物，具有益氣固脫，養陰生津，生脈之藥理作用，臨床上用于治療氣陰兩虛型之休克，冠心病，病毒性心肌炎，慢性肺心病，粒細胞減少癥等疾病.本實驗通過實驗探討以鱟試劑法取代熱原法檢測參麥注射液中細菌內毒素的可行性。
細菌內毒素檢測發(BET)法是利用鱟試劑來檢測或量化革蘭氏陰性菌產生的內毒素的一種方法。本方法包括兩種檢查方法，即凝膠法和光度測定法。本實驗所采用的為凝膠法，是利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反映的機理，檢測供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。該方法較熱原檢測法靈敏，準確，快速和經濟。美國藥典(USP)，英國藥(BP)，歐洲藥典(EP)及日本抗生物質基準均收載了許多品種從熱原檢測法改為細菌內毒素檢測法。[1]縱觀各國動向以BET法取代熱原法是大勢所趨，同時也是反映檢驗水平提高及標準化的一個重要標志。
2 實驗材料與方法
2.1材料
2.1.1鱟試劑（廈門鱟試劑實驗廠，批號：20070131靈敏度λ=1.0EU/ml；批號：20080125，靈敏度λ=0.125EU/ml.）鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號20080307 靈敏度λ=0.125EU/ml）。
2.1.2細菌內毒素檢測用水（鱟實驗用水）（廈門鱟試劑實驗廠 批號20080124；2ml/支）。
2.1.3細菌內毒素標準品（WSE）（中國生物制品檢定所，批號20080321；10EU/支）。
2.1.4參麥注射液（四川川大華西藥業公司，10ml/支，批號20080125；批號20080321）。參麥注射液（河北神威藥業有限公司，10ml/支，批號20080521）。
2.1.5等滲氯化鈉注射液（哈爾濱三聯藥業公司，250ml/瓶，批號20080120）。
2.1.6細菌內毒素檢測用具（廈門鱟試劑實驗廠）均干熱滅菌一小時以上。
2.2方法
2.2.1鱟試劑的靈敏度的復核
按《中國藥典》（2005版）附錄之“細菌內毒素檢測法”[2]項下所規定的“鱟試劑靈敏度復核試驗”的內容操作。將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上，混勻15min，然后分別稀釋成2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ（即1.0EU/ml，0.5EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml）四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步，均應在旋渦混合器上混勻30S，每一濃度平行做4支，同時用鱟實驗用水做2支陰性對照管。根據公式λc=1g-1 (Σx/4)分別計算三個批號鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。式中X為待復核鱟試劑反應終點濃度的對數值(見表1)。λc均在0.5λ～2.0λ范圍內(即0.25≤λ≤1.0)故此鱟試劑可用于細菌內毒素檢查并以λ=0.5EU/ml作為三批鱟試劑的靈敏度。
2.2.2干擾預試驗
2.2.3細菌內毒素限值(L)的確定[3]
參麥注射液臨床每次最大用量為40 ml， 加入于250 ml等滲氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液中，在一小時內滴注完畢.根據2005年版《中國藥典》規定的藥品細菌內毒素限值計算公式，L=K/M得出，M=40/（1*60）=0.67ml/(kg·h)(輸液時間不足一小時按一小時計算，人均體重按60 kg計算。靜脈注射計的致熱閾值K為5EU/（kg·h）。因此細菌內毒素限值L=K/M=5/0.67=0.75 EU/（kg·h）
2.2.4稀釋供試品[4-5]
計算參麥注射液有效倍數MVD，按公式：MVD=L/Lλ
當Lλ為1.0，0.5，0.25，0.125，0.063EU/ml時相應的MVD(λ=1.0)=7.5，MVD(λ=0.5)=15，MVD(λ=0.25)=30 ，MVD(λ=0.125)=60 ，MVD(λ=0.063)=120，用細菌內毒素檢查用水把供試品吸釋成以上五個濃度備用。
2.2.5稀釋內毒素工作標準品
用上述不同濃度樣品系列溶液將內毒素工作標準品稀釋成2.0EU/ml的濃度備用。
2.2.6加樣及反應
進行供試品陰性對照(NPC)和供試品陽性對照(PPC)兩個系列的反應。NPC系列 取上述經靈敏度復核合格的鱟試劑(λ=1.0EU/ml)加細菌內毒素檢查用水溶解，分別取0.1ml于8支反應管中再各加入上述稀釋好的供試品0.1ml，每一供試品濃度，重復兩反應管。PPC系列 取上述鱟試劑（λ=1.0EU/ml）加細菌內毒素檢查用水溶解，分別取0.1ml于8支反應管中，再各加上述稀釋好的2λ的內毒素工作標準品0.1ml，每一供試品濃度重復兩反應管。將兩系列的反應管置于（37±1）℃水浴中，保溫(60±2)min，反應結果（見表2）
2.2.7干擾試驗
根據干擾預試驗結果，應選擇供試品稀釋倍數為60倍的進行干擾試驗，即內毒素限值為0.125EU/ml。為考察對于λ=0.125EU/ml的不同廠家鱟試劑，樣品在低于60倍稀釋時是否也不存在干擾，用細菌內毒素檢查用水將樣品稀釋30 倍及60倍后，分別進行干擾試驗。干擾試驗按《中國藥典》2005年版細菌內毒素檢查法的供試品干擾實驗項進行，結果（見表3）。
藥典規定當Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）及Et在0.5Es～到2.0Es（包括0.5Es～2.0Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗沒有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，在重復干擾試驗。
實驗結果顯示，對于λ=0.125EU/ml的不同廠家鱟試劑，樣品稀釋30倍時，Es在0.5～2.0λ但Et不在0.5～2.0Es范圍，存在干擾，而樣品稀釋60倍時Es在0.5～2.0λ且Et在0.5～2.0Es范圍，故認為將供試品稀釋60倍以上時對不同廠家，生產的鱟試劑不產生干擾。
2.2.8細菌內毒素檢查法與熱原檢查法對比試驗
2.2.9熱原檢查法
取上述三批參麥注射液按《中國藥典》2005年版附錄“熱原檢查法”檢查。三批供試品檢查結果均為陰性。（見表4）
2.2.10細菌內毒素檢查法
取上述參麥注射液體（每批各取5支）分別用細菌內毒素檢查用水稀釋60倍，使用靈敏度λ為0.125EU/ml的鱟試劑按《中國藥典》2005年版附錄之“細菌內毒素檢查方法”檢查。結果全部呈陰性。
3 結果與討論
3.1上述試驗結果見下列各表：
表1 TAL靈敏度復核實驗
TAL 內毒素濃度（EU/ml） 陰性對照 Λc(EU/ml)
1 0.5 0.25 0.125
20080301 ++++ ++++ ---- ---- -- 0.50
20080125 ++++ ++++ +--- ---- -- 0.42
20080307 ++++ ++++ ---- ---- -- 0.50
表2 參麥注射液干擾預試驗
供試品稀釋倍數 7.5 15 30 60
NPC系列 -- -- -- --
PPC系列 -- -- -- ＋＋
表3 參麥注射液干擾實驗結果
樣品稀 鱟試劑廠家 樣品批號 內毒素濃度(EU·ml-1) 陰性 結果
釋倍數 0.25 0.125 0.06 0.03 對照
30 廈門鱟試劑試試驗廠 檢查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.125
川大華西藥業 20080125 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
河北神威藥業 20080321 +++- ---- ---- ---- -- Et=0.297
河北神威藥業 20080521 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
湛江安度斯公司 檢查用水 ++++ ---- ---- ---- -- Es=0.149
川大華西藥業 20080125 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.297
河北神威藥業 20080321 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.353
河北神威藥業 20080521 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
60 廈門鱟試劑試驗廠 檢查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.125
川大華西藥業 20080125 ++++ ++++ ---- ---- -- Et=0.149
河北神威藥業 20080321 ++++ ++++ -+-- ---- -- Et=0.104
河北神威藥業 20080521 ++++ ++++ ++-- ---- -- Et=0.089
湛江安度斯生物有限公司 檢查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.149
川大華西藥業 20080125 ++++ ++++ -+-- ---- -- Et=0.104
河北神威藥業 20080321 ++++ ++++ ---- ---- -- Et=0.149
河北神威藥業 20080521 ++++ ++++ +--- ---- -- Et=0.104
表4 熱源實驗結果
生產廠家 供試品批號 檢查結果
四川川大華西藥業公司 20080125 （―）
四川川大華西藥業公司 20080321 （―）
河北神威藥業公司 20080521 （―）
3.2討論
3.2.1注射劑質量控制中，采用家兔法檢驗細菌內毒素。由于操作復雜。影響因素多，而且費時。采用鱟試驗法，操作簡單迅速，且靈敏度高。
3.2.2 BET法檢查細菌內毒素的反應機制如下：內毒素在鈣，鎂二價陽離子的參與下，首先激活TAL凝固酶系統的C因子，最后將凝固蛋白原變成凝固蛋白。除與內毒素反應外，TAL與β—葡聚糖反應造成假陽性，所以對一個新品種進行BET法的可行性探討中，最突出的即為干擾實驗，當藥品中存在干擾因素時，均可導致結果異常，干擾實驗就是確定供試品在什么范圍內進行細菌內毒素檢查，既可克服干擾因素，又能客觀的反映出供試品所含內毒素是否符合規定限值，為了排除干擾，通常采用稀釋法。如果樣品在高濃度時對細菌內毒素無干擾，則在更低濃度時也不會產生干擾。
3.2.3初篩試驗只是一種預試驗，最終要經干擾試驗驗證，其目的是評價樣品濃度對鱟試劑與內毒素凝集反應的干擾程度及干擾性質，以便初步篩選出對檢查無干擾的樣品濃度范圍，及相應的鱟試劑靈敏度，從而為干擾試驗提供必要的參數，避免鱟試劑的浪費。從表3結果可看出，樣品對細菌內毒素檢查的干擾性質為抑制作用，樣品對鱟試劑無干擾的有效稀釋倍數為60倍。在此有效濃度以下可以選擇靈敏度為0.125EU/ml以上的鱟試劑對相應的樣品稀釋濃度做干擾試驗。
由干擾試驗結果可看出，三批樣品分別使用不同廠家生產的鱟試劑，將樣品稀釋60倍，其Es在0.5λ～2.0λ且Et在0.5Es～2.0Es.按2005年版本《中國藥典》干擾試驗的判斷方法，可以認為樣品在該濃度下不干擾細菌內毒素的檢查，因此將樣品稀釋60倍進行細菌內毒素的檢查是可行的。
參 考 文 獻
[1] 李勇軍，胡昌勤，金少鴻.四國藥典抗生素品種細菌內毒素限值的比較.中國藥事，2000，14（2）：110.
[2] 中國藥典.2005年版，附錄XI,E,85.
[3] 黃清泉，夏振民.藥品細菌內毒素檢查的實驗設計. 藥學雜志.1997，32（2）：72.
[4] 苑慶華，唐元泰，趙海山等.右旋糖酐20葡萄糖注射液細菌內毒素檢測.藥物分析雜志.2001，21（4）：293.
[5] 施震，尹銀嘉，李華.注射用頭孢替唑中細菌內毒素的檢測.中國藥學雜志.2003，38（5）：377.
www.chinaqking.com 期刊門戶-中國期刊網 來源:《中外健康文摘》2009年第16期供稿文/隋秋林 (哈爾濱市第四醫院 黑龍江哈爾濱 150026）
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