【摘要】 目的：確定甘氨酰谷氨酰胺細(xì)菌內(nèi)毒素鱟試驗(yàn)檢查法的可行性。方法：供試品干擾試驗(yàn)后，采用凝膠鱟試驗(yàn)對樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測。結(jié)果：三批樣品稀釋至20 mg/mL、10 mg/mL時(shí)，對細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測均無干擾作用，樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量均小于0.025 EU/mg。結(jié)論：所建立方法檢查甘氨酰谷氨酰胺的細(xì)菌內(nèi)毒素可行。
【關(guān)鍵詞】 甘氨酰谷氨酰胺；細(xì)菌內(nèi)毒素；鱟試驗(yàn)；干擾試驗(yàn)
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是藥品一個(gè)非常重要的安全指標(biāo)。特別對注射用原料藥和注射用制劑藥。近年來，世界各國越來越多地以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查藥品和生物制品中致熱物質(zhì)來代替兔法進(jìn)行熱原檢查。甘氨酰谷氨酰胺（GlycylGlutamine）溶解度大，進(jìn)入人體內(nèi)迅速水解為甘氨酸和谷氨酰胺而發(fā)揮作用。谷氨酰胺是人體內(nèi)的一種條件必需氨基酸。臨床上谷氨酰胺、酪氨酸與支鏈氨基酸以二肽形式應(yīng)用于急性胰腺炎、肝、腎、骨骼肌患者的相應(yīng)氨基酸供應(yīng)，如復(fù)方氨基酸（15）雙肽注射液。《中國藥典》2005年版尚未收載該品種。我們對3批樣品進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，以考察該方法的可行性。
1 藥品與試劑
甘氨酰谷氨酰胺（四川思達(dá)康藥業(yè)有限公司，批號：050701、050702、050703）；細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：20042）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物制品有限公司，批號：0504300）；鱟試劑（湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.25 EU/mL,批號：0510311），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.25 EU/mL，批號：0602072）。
2 方法與結(jié)果
2.1 鱟試劑靈敏度的復(fù)核
照文獻(xiàn)［1］附錄規(guī)定的方法，對實(shí)驗(yàn)所用的鱟試劑（TAL）進(jìn)行靈敏度復(fù)核。結(jié)果鱟試劑的實(shí)測靈敏度均在0.5～2.0 λ之間，符合規(guī)定。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)取λ作為鱟試劑的靈敏度［2］。
2.2 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定
參照《中國藥典》確定樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L），L=K/M，K為人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，非放射性藥品靜脈途徑給藥時(shí)K值為5 EU/(kg·h)，M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以mg/(kg·h)表示，人均體重按60 kg計(jì)算，甘氨酰谷氨酰胺現(xiàn)在臨床最大用量約為50 mg/kg。L值應(yīng)為6 EU/mg。參照《中國藥典》2005年版二部甘氨酸原料細(xì)菌內(nèi)毒素的限度值（0.02 EU/mg）［1］和臨床用量，根據(jù)生產(chǎn)控制從嚴(yán)的實(shí)際情況，綜合生產(chǎn)、臨床用藥和檢驗(yàn)的實(shí)際情況，將甘氨酰谷氨酰胺的L值定為0.025 EU/mg。2.3 樣品的干擾試驗(yàn)
確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD），照文獻(xiàn)［1］附錄規(guī)定樣品為原料藥，MVD取1，可計(jì)算樣品的最小有效稀釋濃度c=λ/L，用λ=0.25 EU/mL鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，即樣品最小稀釋濃度為10 mg/mL，將樣品稀釋至40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL濃度。取“2.1”項(xiàng)下鱟試劑，分別對3批已檢測細(xì)菌內(nèi)毒素不超標(biāo)的樣品，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)。樣品在表1所述3種濃度下，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾［2］。表1 樣品的干擾預(yù)試驗(yàn)(略)
參照文獻(xiàn)［1］取2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，分別對3批樣品濃度為20 mg/mL、10 mg/mL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)確認(rèn)，并計(jì)算以樣品稀釋液配制的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何均值（Et）及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制的內(nèi)毒素溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何均值（Es），結(jié)果見表2。表2 干擾試驗(yàn)（略）
通過上述干擾試驗(yàn)的結(jié)果表明，供試品在20 mg/mL、10 mg/mL濃度下，進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，其Et與相應(yīng)的Es均在0.5～2.0之間，且Es在0.5～2.0 λ之間，說明供試品在20 mg/mL、10 mg/mL對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾。
2.4 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢查
參照文獻(xiàn)［1］，取上述3批甘氨酰谷氨酰胺稀釋至10 mg/mL后，以λ=0.25 EU/mL的鱟試劑，按常規(guī)凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（表3）。結(jié)果樣品在10 mg/mL中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于0.025 EU/mg，且對鱟試驗(yàn)檢查無干擾作用。表3 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢查（略）
3 討論
凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法，條件是適宜的溫度、pH值及無干擾作用。因此，新藥品種是否可用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代兔法熱原檢查，首先要證實(shí)是否存在干擾因素，確定該品種在有效濃度范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)既可以克服干擾因素，又能客觀地反映其所含細(xì)菌內(nèi)毒素的限值［3］。在確定了甘氨酰谷氨酰胺的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.025 EU/mg后，取3批樣品，用2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明樣品在20 mg/mL、10 mg/mL對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾作用。從而證實(shí)可以建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值應(yīng)小于0.025 EU/mg。
【參考文獻(xiàn)】
［1］中華人民共和國國家藥典委員會. 中國藥典［S］. 二部. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 附錄70, 8687.
［2］肖貴南, 李瑾翡, 吳招娣. 鱟試驗(yàn)測定乙酰谷酰胺氯化鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素［J］. 華西藥學(xué)雜志, 2006, 21(40): 390391.
［3］肖貴南, 區(qū) 璇, 陸惠文, 等. 鹽酸普羅帕酮注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試驗(yàn)研究［J］. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2004, 20(2): 226229.
（作者：劉華，黃明，周莉） |
