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雞白介素-4（IL-4）ELISA試劑盒試劑盒僅供研究使用 預(yù)期應(yīng)用 實(shí)驗(yàn)原理 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成5 ng/mL，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.16 ng/mL，0.08ng/mL其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。 如配制5 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。 4. 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。 5. 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。 6. 檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A1：100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。 7. 檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。 8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 標(biāo)本的采集及保存 1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul（取1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。 3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。 5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。 6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。 7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。 8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。 注： 1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。 3. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。 4. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 計(jì)算 注意事項(xiàng) 2． 一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 3． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。 4． 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀釋倍數(shù)。 5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 6．底物請(qǐng)避光保存。 檢測(cè)范圍： 說(shuō)明 2．有效期：6個(gè)月 3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。 5．中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。 |
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