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一、限制性內切酶酶切注意事項 在進行限制性酶切反應過程中,影響限制性酶切反應效果的因素較多,要設計酶切反應,一般均應考慮諸如酶切系統、溫度條件、反應體積、底物性質及星型反應等因素。根據各種不同的條件,酶切反應的設計一般應注意以下問題： 1. 大多數限制酶貯存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃條件下結冰。當最終反應液中甘油濃度大于12%時,某些限制酶的識別特異性降低,從而產生星活性,更高濃度的甘油會抑制酶活性。因此加入反應的酶體積不超過反應總體積的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影響。 2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋,但切勿用水稀釋以免酶失活,用水稀釋的酶不能長期保存。 3. 反應體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子,當用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時,酶活性會被抑制,或改變酶的特異性,導致星型反應。 4. 多種因素可引發星型反應：①非最適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在(>12%)；⑥有機溶劑的存在。 5. 反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大,小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴散,并降低酶活性。建議酶切反應的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。 6. 酶切反應所加入的酶量應適中,根據底物的種類、量的多少和體積的大小而定,對不同的限制酶,各廠家均有一最大的消化量指標可參考。 7. 當要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時,如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好,則兩種酶可同時切割,如果這些酶所要求的緩沖液有所不同,則可采用以下兩種替代方法：①先用在低離子強度的緩沖液中活性高的酶切割DNA,然后加入適量NaCl及第二種酶,繼續反應；②使用能夠使多數內切酶均表現較高活性的單種緩沖液。 8. 用同一種酶切割不同的DNA時,所需酶量不同,可根據DNA底物上酶切位點的多少與λDNA存在位點的數目比較后,決定用酶量。對于超螺旋DNA,基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA,使用的酶單位活性應適當加大。 9. 反應混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA,可維持酶的穩定性。 10.酶切底物DNA應具備一定的純度,其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醚,大于10mM的EDTA,去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度,否則會不同程度地影響限制酶的活性。 11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個重要因素,所以轉化實驗所選擇的受體菌株應考慮到使用的菌株中的酶修飾系統。 12.要保證酶作用時的最佳反應條件(ph, 溫度)和底物用量,酶反應才能有效地進行。 13.反應取酶時應使用無菌吸頭,以免污染酶液,同時應盡量縮短酶在溫室的放置時間。 14.高于37℃或需長時間保溫時,可加入礦物油覆蓋在反應液上以減少水分蒸發。 15.反應混合物混勻時,應避免強烈振蕩以保證不使內切酶變性及DNA大分子的完整。 16.反應前的低速離心是必要的,這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 17.用已硅化的離心管進行酶切反應,可獲得更佳的酶切效果,否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。 18.終止酶反應可根據需要采用不同的方法：①酶切后不需進行下一步反應,可加入含EDTA的終止液終止反應；②若需進一步反應(如連接,切割等),可將反應管置65℃保溫20-30分鐘,以滅活酶終止反應。③可用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀獲得較純DNA進行下一步酶學操作。 19. 不同廠家的試劑不可混用,需要時請查明相關條件及數據。 二、限制性酶解中常見的問題及解決措施 限制性酶切割DNA底物的操作過程中,會出現一些問題,產生的原因主要為酶解體系中各要素處于非最佳狀態,包括DNA的純度和特性,反應緩沖液、反應體積、反應時間及溫度等。 問題 原因 解決辦法 DNA完全沒有被內切酶切割 1) 內切酶失活 標準底物檢測酶活性 2) DNA不純,含有SDS,酚,EDTA等內切酶抑制因子 將DNA過柱純化,乙醇沉淀DNA 3) 條件不適(試劑、溫度) 檢查反應系統是否最佳 4) DNA酶切位點上的堿基被甲基化 換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新將質粒DNA轉化至dcm-,dam-基因型的細菌菌株 5) DNA酶切位點上沒有甲基化(如Dpn I) 換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA(如San3A I代替Dpn I),重新將質粒轉至dcm+ dam+菌株中擴增 6) DNA位點上存在其它修飾 將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證 7) DNA不存在該酶識別順序 換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證 DNA切割不完全 1) 內切酶活性下降 用5-10倍量過量消化 2) 內切酶稀釋不正確 用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 3) DNA不純,反應條件不佳 同上 4) 內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 同上 5) 部分DNA溶液粘在管壁上 反應前離心數秒 6) 內切酶溶液粘度大,取樣不準 將內切酶稀釋,增大取樣體積 7) 酶切后DNA粘末端退火 電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘,取出后置冰浴驟冷 8) 由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性 使用標準反應緩沖液及溫度,避免強烈振蕩 9) 過度稀釋使酶活性降低 適當稀釋酶液,反應液稀釋的酶不能貯藏 10)反應條件不適 使用最佳反應體系 11)識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序 加大酶量5-10倍 DNA片段數目多于理倫值 1) 內切酶星狀活性 檢查反應條件：甘油濃度大于12%,鹽度過低,Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導致星狀活性,降低酶的用量 2) 其它內切酶污染 用λDNA作底物檢查酶切結果 3) 底物中含其它DNA雜質 電泳檢查DNA,換用其它酶切,純化DNA片段 酶切后沒有觀察到DNA片段的存在 1) DNA定量錯誤(如RNA含量較高) 用RNA酶A(無DNA酶)100ug/ml消化DNA樣,酚抽提后沉淀溶解,定量 2) 在酶切反應液中形成非特異的沉淀 在反應前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次 內切酶保存期內快速失活 1) 保存溫度不合適 內切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中,應在-20℃低溫保存 2) 以稀釋形式保存 稀釋酶液不宜長期存放,應一次使用 3) 貯藏緩沖液不適當 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 4) 低蛋白濃度 內切酶與500ug/ml的BSA一起保存 電泳后DNA片段的帶型彌散,不均一 1) DNA上結合有蛋白質 電泳前上樣液65℃加熱5min,并加入0.1%的SDS,酚/氯仿抽提純化 2) 內切酶中含有DNA外切酶 減少酶用量或消化時間,換用新包裝的酶 酶切后的DNA片段連接效率低 1) 含磷酸鹽的濃度高 透析,乙醇沉淀去除磷酸鹽 2) 內切酶失活不全或含有ATP酶 延長滅活時間或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA 3) 平末端連接 加大T4 DNA Ligase用量 4) 外切酶污染 減少酶用量,縮短保溫時間,酚抽提回收DNA 5) 連接緩沖液不合適 重新配制連接緩沖液 三、DNA分子量標準問題分析 問題 原因 解決辦法 帶弱或無DNA帶 1) 上樣DNA的量不夠 增加DNA的上樣量,聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高 2) DNA降解 避免DNA的核酸酶污染 3) DNA走出凝膠 減短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度 4) 對于EB染色的DNA,所用紫外光源不合適 應用短波長(254nm),紫外燈增強靈敏度 DNA帶缺失 1) 小DNA帶走出凝膠 減短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度 2) 分子大小相近的DNA帶不易分辨 增加電泳時間,核準正確的凝膠濃度 3) DNA 變性 電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,以20mM NaCl Buffer稀釋DNA 4) 巨大DNA鏈,凝膠電泳不合適 在脈沖電聲凝膠電泳上分析 DNA帶模糊 1) DNA降解 避免核酸酶污染 2) DNA上樣量過多 減少凝膠中DNA上樣量 3) 所用電泳條件不合適 電泳時電壓不應超過20V/cm,溫度<30℃,巨大DNA鏈,溫度應<15℃,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力 4) DNA樣含鹽過高 電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽 5) 有蛋白污染 電泳前酚抽提去除蛋白 6) DNA變性 電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA 不規則DNA帶遷移 1) 對于λ/Hind III片段COS位點復性 電泳前加熱DNA 65℃加熱5-10分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘 2) 電泳條件不合適 電泳電壓不超過20V/cm,溫度<30℃,電泳緩沖液有足夠的緩沖能力 3) DNA變性 以20mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱 以λ/Hind III為代表的λDNA酶切片段用作電泳分析中的分子量標準,會發現電泳后分子量條帶不對的問題,解釋原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在著12個堿基組成的具有互補順序的單鏈突出端-COS位點,COS位點的退火復性,在λDNA片段電泳分離時會出現問題,含左右臂片段在膠上應出現的地方條帶會減弱或完全看不到,而復性的左右臂片段會結合成大的片段,即在較大的分子量區域內產生一個額外的條帶,這就造成了不正常的帶型。解決以上問題的辦法,是在電泳之前,把DNA分子量標準67℃加熱約10分鐘,然后立即放入冰浴中驟冷,待樣品冷卻后上樣。這樣即可解離復性的粘性末端,使電泳過程DNA片段形成正常的帶型分布。 四、凝膠電泳操作注意事項 1. 緩沖系統：在沒有離子存在時,電導率最小,DNA不遷移,或遷移極慢,在高離子強度的緩沖液中,電導很高并產熱,可能導致DNA變性,因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時,常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環是可取的。 2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖,其雜質含量不同,影響DNA的遷移及熒光背景的強度,應有選擇地使用。 3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致,溶解的凝膠應及時倒入板中,避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡,影響電泳結果。 4. 樣品加入量：一般情況下,0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量,加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定,過多的量會造成加樣孔超載,從而導致拖尾和彌散,對于較大的DNA此現象更明顯。 5. 電泳系統的變化會影響DNA的遷移,加入DNA標準參照物進行判定是必要的。 6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率,平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。 7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度,遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子,制備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。 |
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