|
ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫學科學的許多領域。
ELISA基本原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
ELISA基本操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
在包被溶液中稀釋純化的包被抗體（一般0.5-4μg/ml），將該稀釋后的包被抗體100μl/孔加入到酶標板內。
用封板膜將板封好防止蒸發，在室溫（或4℃）孵育過夜。
吸干每一板孔并加洗液洗滌，重復3次。使用洗瓶、多道移液器、多功能分裝器或洗板幾，每孔加400μl徹底洗滌。規范的操作要求每步完全移出孔中的液體。最后一步，將板中液體移出并將板子在干凈的紙巾上吸附。
加200-300μl/孔封閉液封板，室溫至少孵育1小時。
重復步驟3，可利用真空泵干燥板子。加入干燥劑并封板，至少在4-8℃可貯存2個月。
每孔加100μl適當稀釋的標準品和標本，輕輕敲打板子1分鐘。貼上封板膜，室溫孵育2小時。
重復步驟3
每孔加100μl經過適當稀釋的生物素化的檢測抗體，貼上新的封板膜，室溫孵育2小時
重復步驟3
每孔加100μl經過適當稀釋的Avidin-HRP或 Streptavidin-HRP，也可加其它種類預先優化物
重復步驟3
每孔加100μl底物溶液，避光，室溫孵育5-30分鐘進行顯色反應
每孔加50μl終止液，輕輕振蕩板子確保充分混勻
結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)
↓
于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
↓
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
ELISA需要的基本試劑：
捕獲抗體
檢測抗體
鏈霉親和素-HRP
標準品
96孔酶標板：選擇具有中等或高吸附力的酶標板，禁止使用培養板
包被溶液：0.1M的PBS或者TBS，PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液
阻斷溶液：含3％BSA的TTBS或PBS，或者含有3-5%血清的PBS
標準品/標本稀釋液：含1％BSA的TTBS或PBS
洗液：含0.02％吐溫20的0.002M咪唑鹽溶液或者PH7.4的PBS溶液
底物溶液：兩組份或者一組份的TMB顯色液
終止液：2N的硫酸或者1％HCl溶液
封板膜
ELISA標本的制備和貯存
檢測可溶性蛋白：根據產品說明書制備血清、血漿標本，由于有些樣品對溫度敏感極易喪失活性，應盡快分離并分裝（一般300～500ul/管），大多數標本收集和實驗在同一天應貯存在2～8℃。若無法立即測定，應貯存在-70℃，標本貯存時間一般不宜過長，避免反復凍融。使用前將標本平衡至室溫，融化標本嚴禁使用水浴鍋。凍存后或冷藏時間過長的標本可能會出現沉淀或小凝集塊，應在實驗前離心或過濾（0.45um濾膜）標本，體積少的標本不建議過濾。所有標本的收集要使用無菌管，在無菌/半無菌條件下操作防止污染。
血清：將血液在室溫凝集10～15分鐘，1500g離心20～30分鐘，小心吸取血清。
血漿：按試劑盒中的說明書選擇抗凝劑。收集血液時，輕輕搖動試管使抗凝劑與血液充分混合。將血液在室溫保存10～15分鐘，1500g離心15～20分鐘，小心吸上層血漿。
尿液：將尿液收集在無菌的容器內。1500g離心10～15分鐘或過濾（0.45um濾膜）去除雜質。注意：對于尿液標本實驗的回歸系數可能發生變化。
細胞培養上清液：1500g離心10～15分鐘去除細胞和細胞殘渣。若使用常規典型的培養基，應制備兩條標準曲線，一條使用標準品稀釋液/或實驗緩沖液配制標準品，另一條以細胞培養基配制標準品。若兩條標準曲線的變化范圍在10%內，實驗結果可用任一曲線分析。
檢測細胞相關和細胞內蛋白：細胞相關蛋白和其它細胞內蛋白在ELISA實驗前需要對標本進行處理將目的蛋白釋放出來。
|
