內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0109/4983.html
上皮細(xì)胞培養(yǎng)
1）表皮細(xì)胞培養(yǎng)
1．取材：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成0.5～1 平方厘米小塊。
2．EDTA 處理：先置入0.02％EDTA 中室溫置5 分鐘。
3．冷消化：換入0.25％胰蛋白酶中，置4℃過(guò)夜。
4．分離：取出皮膚，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)。
5．溫消化：取出表皮單獨(dú)處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30～60 分鐘。
6．用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液。
7．培養(yǎng)液：通過(guò)80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清，制成細(xì)胞懸液，接種入碟皿中，CO2 溫箱培養(yǎng)。
2） 乳腺組織培養(yǎng)
直接培養(yǎng)法：（適于培養(yǎng)含纖維少的軟組織）
1．在含有少量培養(yǎng)液或Hanks 液的容器中，用鋒利刀片將組織反復(fù)切割成碎塊。
2．把組織碎塊連同液體注入離心管中，再補(bǔ)加少許培養(yǎng)液，用吸管吹打片刻，置試管架3～5 分鐘。吸除上層液可排除非乳腺細(xì)胞部分。重復(fù)2～3 次。
3．末次處理結(jié)束后，向沉降管中再補(bǔ)加培養(yǎng)液，用吸管稍吹打，使沉降物重懸。不待細(xì)胞團(tuán)塊下降立即通過(guò)3～4 層無(wú)菌紗布濾入另管中。
4．調(diào)整好適宜密度，接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
膠原酶消化法：（適于處理含纖維多的較硬組織）
其過(guò)程與培養(yǎng)其它組織相同。
3） 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)
1．取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠(yuǎn)端非病變區(qū)粘膜少許。
2．清洗：用含慶大霉素（400 微克/毫升）和二性霉素（2 微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm3 大小。
3．消化：在I 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于37℃中消化80 分鐘。
4．離心：收集細(xì)胞懸液，800 轉(zhuǎn)/分離心后，Hanks 液漂洗兩次。
5．接種：末次離心后加入含有1％～2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中，接種量依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?
4） 肝細(xì)胞培養(yǎng)
初代組織塊培養(yǎng)：
取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3 左右的小塊，采用帖壁培養(yǎng)法。
初代消化法培養(yǎng)：
1．把肝組織切成2～4 立方毫米的小塊，用不含鈣鎂的BSS 液洗兩次。
2．移入1：1 的0.1％胰蛋白酶和0.1％膠原酶（都用無(wú)鈣鎂BSS 配置）中，4℃冷消化10～12 小時(shí)后，通過(guò)250 微米和64 微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)。
3．收集細(xì)胞、BSS 液洗1～2 次、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)。
消化培養(yǎng)肝細(xì)胞的另一種方法是灌流法（肝臟灌流需用全肝，以較小動(dòng)物如小鼠和大鼠為好）：
1．無(wú)菌解剖動(dòng)物，取出肝臟，先用BSS 洗除血污。
2．取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線(xiàn)繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入肝管系統(tǒng)，并不時(shí)輕揉壓肝臟，以便消化液進(jìn)入肝小葉中；消化液在肝內(nèi)停留20～30 分后，在吸出消化液的同時(shí)并輕揉壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出。
3．待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)（較其它培養(yǎng)基為好），能獲得較純的肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。
傳代培養(yǎng)：
待細(xì)胞生長(zhǎng)連接成片后，用BSS 洗一二次，加1：1 的0.025％胰蛋白酶和0.02％ EDTA 混合消化3～5 分鐘，待細(xì)胞回縮，便停止消化，棄掉消化液，用BSS洗一二次，注入營(yíng)養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液，再接種培養(yǎng)。
5）內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
1．取產(chǎn)后的新鮮臍帶。如不立即培養(yǎng)可以保存于4℃中，但不宜超過(guò)12 小時(shí)。無(wú)菌剪取長(zhǎng)10～15 厘米一段。其它如胚胎和幼體動(dòng)物的大血管，亦可用于培養(yǎng)。
2．先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的靜脈中，洗除殘血，注入口處宜用線(xiàn)繩結(jié)扎，以防液體返流。
3．用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿(mǎn)血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化3～10 分鐘。
4．吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中，為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫PBS 沖洗2～3 次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管中離心。
5．吸除上清，加1640 培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時(shí)2～3 天內(nèi)細(xì)胞即可長(zhǎng)成單層。
6）毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
腫瘤條件培養(yǎng)基制備：
1．取C3H 小鼠的S-180 實(shí)體肉瘤組織。
2．胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培養(yǎng)液15ml（含10％小牛血清），接種到T-75 Falcon 產(chǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3．在細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全匯合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲得多量條件培養(yǎng)基。
4．4000 轉(zhuǎn)/分離心后，再通過(guò)0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)，－20℃凍存?zhèn)溆茫ㄅR用前融解）。
初代培養(yǎng)：
1．取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個(gè)，先用Hanks 液洗除血污。
2．剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成1 立方毫米小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1 小時(shí)，每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分。
3．通過(guò)不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，網(wǎng)眼要求只允許能通過(guò)小于110 微米長(zhǎng)的毛細(xì)血管小段。
4．650rpm，4℃，離心7 分鐘后，棄掉上清膠原酶。
5．沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次。
6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打。
7．接種于鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)頭1～3 小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先帖附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂浮。
8．趁此時(shí)，吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液，每?jī)商鞊Q液一次。毛細(xì)血管小段一般成自1～4 個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，以后每個(gè)小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)2～5 天。
毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：
1．初代培養(yǎng)2～3 天后，鏡下確認(rèn)幾個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起。
2．鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細(xì)胞解剖器或用手操作均可，宜在凈化臺(tái)無(wú)菌氣流中、打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（15～20 分鐘），圈內(nèi)非內(nèi)皮細(xì)胞可用無(wú)菌膠刮除。
3．用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞。
4．剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如?。?～20 個(gè)細(xì)胞）而少時(shí)，生長(zhǎng)增值變得緩慢或不完全不生長(zhǎng)，此時(shí)需加入3T3 等飼細(xì)胞，飼細(xì)胞接種量為4000 細(xì)胞/cm2。
5．當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿(mǎn)所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基。
6．接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)（飼細(xì)胞死亡淘汰），細(xì)胞增殖生長(zhǎng)匯合后，按1：5 傳代。
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