對骨髓基質干細胞進行改造,使其在保持快速生長的同時向成骨細胞方向分化是目前國內外研究的熱點。實驗發現,成熟的成骨細胞可以通過細胞間的直接接觸作用促進骨髓基質干細胞增殖[ 1 ] ,此外成骨細胞可產生多種生長因子促進其骨髓基質干細胞的增殖、分化[ 2 ] 。由于骨髓基質干細胞通過誘導向成骨細胞分化后,難以再與原有的成骨細胞區分開,因此,本實驗將骨髓基質干細胞與成骨細胞以1∶1 的比例直接混合培養,同時將成骨細胞和骨髓基質干細胞在與混合培養細胞完全相同的條件下單獨進行培養并取其平均值作為對照,以細胞計數、細胞堿性磷酸酶(ALP) 染色陽性率、細胞培養液上清中堿性磷酸酶含量、細胞形成鈣結節數目為觀察指標,將混合培養細胞與相應成骨細胞及骨髓基質干細胞指標的平均值進行比較,觀察兩者的區別。
1 材料與方法
1 .1 材料
無酚紅DMEM 培養液(Hyclon 公司)、胎牛血清(杭州四季清公司)、淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)、堿性磷酸酶染色液及測試盒(南京建成生物工程研究所)。
1 .2 方法
1 .2 .1 成骨細胞分離培養及鑒定
1 .2 .1 .1 成骨細胞分離、培養 孕28 d 青紫蘭兔[南京安立默科技有限公司提供,合格證號scxk(蘇)2002- 0002] ,按1 ml•kg- 1 的3 % 戊巴比妥鈉靜脈麻醉成功后,行剖宮產手術,取出胎兔,術畢注意保持母兔成活。采用酶消化法自胎兔顱骨分離出成骨細胞,用含20 %胎牛血清的DMEM 培養液進行培養。消化剩余的骨組織塊采用貼塊法培養。
1 .2 .1 .2 成骨細胞鑒定 采用細胞形態學觀察、繪制細胞生長曲線[3 ] 、細胞堿性磷酸酶染色、原代細胞匯合后繼續不傳代培養14d 可否形成鈣結節等4 項內容進行成骨細胞鑒定。1 .2 .2 骨髓基質干細胞分離培養及鑒定[ 4 ]對經淋巴細胞液分離的母兔骨髓液中的骨髓基質干細胞,用含20% 胎牛血清的DMEM培養液培養。按與成骨細胞鑒定相同的方法完成對骨髓基質干細胞的鑒定。
1 .2 .3 成骨細胞與骨髓基質干細胞混合培養取生長良好的第3 代骨髓基質干細胞與第3 代成骨細胞進行混合培養,培養條件同單獨培養。觀測指標及平均值計算方法如下。
1 .2 .3 .1 細胞計數 取相同數量的成骨細胞與骨髓基質干細胞充分混勻后以5×104 個•孔- 1 的密度種植于24 孔細胞培養板中培養,共種植48 孔,每隔24 h 用胰蛋白酶消化6 孔,計數細胞數量。各取成骨細胞與骨髓基質干細胞以5×104 個•孔- 1 的密度種植于24 孔細胞培養板中培養作為對照,兩種細胞各種48 孔,每隔24 h 用胰蛋白酶消化6 孔,計數細胞數量。
1 .2 .3 .2 培養液上清中堿性磷酸酶含量測定取相同數量的成骨細胞與骨髓基質干細胞充分混勻后按2×105 個•瓶- 1 的細胞密度接種于50 ml 細胞培養瓶中進行培養,共接種12 瓶。培養開始后3、6、9 d 分別采用試劑盒測定細胞培養液上清中堿性磷酸酶含量。各取成骨細胞及骨髓基質干細胞與混合培養細胞完全相同的條件單獨進行培養。采用與上述相同的方法測定相應指。注意在接種時預先在培養瓶中置入長條形玻片,使成骨細胞組、骨髓基質干細胞組、混合培養細胞組各6 瓶細胞中置有1 塊玻片。
1 .2 .3 .3 培養至第7 天時細胞堿性磷酸酶染色陽性率測定 培養至第7 天時細胞爬滿上述放置于培養瓶中的玻片,將玻片取出,行堿性磷酸酶染色,3 種細胞均各計數6 塊玻片,共600 個細胞(每塊均計數四角及
中央共5 個部位100 個細胞)。按公式:細胞堿性磷酸酶染色陽性率= 染色陽性細胞數/600 ,分別計算出成骨細胞、骨髓基質干細胞、混合培養細胞染色陽性率。
1 .2 .3 .4 單位面積細胞形成鈣結節計數 將未放入玻片的細胞繼續進行不傳代培養,至21 d 時行von kossa染色,計數瓶壁四角及中央4 處共8個０.5 cm×0 .5cm 小方格內細胞形成的鈣結節數目,按公式:鈣結節數= 細胞在8 個小方格內形成的鈣結節總數/8 ,求出成骨細胞、骨髓基質干細胞、混合培養細胞形成的平均鈣結節數量。1 .2 .3 .5 平均值的計算 除細胞堿性磷酸酶染色陽性率為兩種細胞計數總數(染色陽性成骨細胞數+ 染色陽性骨髓基質干細胞數)外,其余各指標的平均值計算公式均為(成骨細胞+ 骨髓基質干細胞)/2。
1 .2 .4 統計學處理
計量指標的比較采用Prism 軟件系統進行分析,率的比較行χ2 檢驗。
2 結 果
2 .1 成骨細胞鑒定
2 .1 .1 形態學觀察
骨組織植塊在培養24 h 后,即可見少量細胞從植塊邊緣爬出,培養2 周左右,相鄰植塊爬出的細胞可以匯合;而分離出的成骨細胞在培養24 h 后,細胞貼壁生長呈長梭形、不規則形,培養10 d 左右細胞基本長
滿培養瓶壁,細胞相互匯合后呈明顯“鋪路石”狀。傳代培養的細胞生長較快,一般接種2 h 即已貼壁,培養4～5 d 細胞即可長滿瓶壁,細胞形態與原代相。
2 .1 .3 堿性磷酸酶染色第1 代成骨細胞經堿性磷酸酶染色后陽性率可達到90 % 以上。
2 .1 .4 鈣結節形成及觀察：成骨細胞連續培養至14 d 時,在培養瓶壁上可見到棕褐色有層次感的鈣結節,經von kossa 染色呈黑色。
2 .2 骨髓基質干細胞鑒定
2 .2 .1 形態學觀察
原代細胞于接種48～72 h 后開始貼壁,貼壁后細胞成三角形、紡錘形;細胞匯合后,呈條索狀、輻射狀;培養1 周左右細胞長滿培養瓶壁。傳代培養的細胞生長加快,一般接種2 h 即可貼壁,3 d 可長滿瓶壁,細胞形態與原代相同。
2 .2 .3 堿性磷酸酶染色第1 代骨髓基質干細胞經堿性磷酸酶染色后多數呈陰性,染色陽性率約為5 %
2 .2 .4 鈣結節觀察
培養至14 d 時,培養瓶壁上可見大量細胞堆積,但未見棕褐色鈣結節形成,經染色后亦未見到染成黑色的鈣結節。
2 .3 成骨細胞與骨髓基質干細胞混合培養
2 .3 .1 細胞計數培養開始后8 d 內混合培養細胞數均高于平均值( P < 0 .05)
2.3.2 培養液上清中堿性磷酸酶含量測定
培養第3、6、9 天混合培養細胞培養液上清中堿性磷酸酶含量均分別高于相應平均值( P < 0 .05)
2 .3 .3 培養至第7 天時細胞堿性磷酸酶染色陽性率測定
培養至第7 天時混合培養細胞堿性磷酸酶染色陽性率為72 % ,明顯高于平均值52 % ( P < 0 .05)
2 .3 .4 單位面積細胞鈣結節形成及計數
培養至21 d 時,混合培養細胞在0 .5 cm× 0 .5 cm面積內形成的鈣結節數目為(15 .60±2 .87)個,明顯高于平均值(9 .33±1 .03)個,兩者比較P < 0 .05。
3 討 論
3 .1 骨髓基質干細胞
目前獲取骨髓基質干細胞的方法主要包括梯度離心法、骨髓液稀釋后直接接種法等,本實驗中采用梯度離心法,我們認為該方法具有簡單易行、快速等優點。骨髓基質干細胞可向成骨細胞轉化,堿性磷酸酶是這一過程的標志性酶之一[ 5 ] ,目前普遍認為堿性磷酸酶在體外鈣化中起著關鍵性作用,即若沒有堿性磷酸酶活性,鈣化就不會發生[ 6 ] 。其主要機制在于堿性磷酸酶能夠水解有機磷酸酶使局部PO4 + 濃度升高,并可破壞鈣化抑制劑,從而啟動鈣化。在細胞內堿性磷酸酶升高的同時,細胞分泌也相應增多,故通過定量測定細胞培養液中堿性磷酸酶的含量及細胞染色的陽性率可反映骨髓基質干細胞轉化程度。
3 .2 成骨細胞
目前提取成骨細胞的主要來源是骨膜和松質骨,培養方法有酶消化法和組織貼塊法。本實驗中采用胎兔顱骨膠原酶消化法進行成骨細胞提取,消化剩余的骨組織再采取貼塊法培養,使胎兔顱骨得到了充分利用。成骨細胞具有分泌作用,可分泌骨形成蛋白(BMP)[ 7 ] 、堿性成纖維細胞生長因子(b?FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)[ 8 ] 、胰島素樣生長因子(IGF)[ 9 ]等,而目前生長因子對骨髓基質干細胞的誘導作用已有定論,采用成骨細胞的培養液提取物促進骨髓基質干細胞的增殖、分化也有文獻報道。
3 .3 骨髓基質干細胞與成骨細胞混合培養的意義
骨髓基質干細胞的多向分化潛能是其成為理想的骨組織工程種子細胞的最大障礙。在將骨髓基質干細胞向成骨細胞定向誘導分化的問題上,現有的幾種方法均存在不足之處:常規誘導液導致細胞生長減慢;使用生長因子尚處于摸索階段,且生長因子昂貴的價格也限制了它的廣泛使用。因此有必要尋找一種新的誘導方法。
從本實驗結果來看,在各時間點上,均是混合培養細胞在細胞增殖、細胞成骨能力上明顯優于平均值。盡管混合培養細胞的細胞數量這一反映細胞增殖能力的指標尚低于骨髓基質干細胞,但與平均值相比仍反映出混合培養細胞的增殖能力、成骨能力較強。骨髓基質干細胞的定向誘導分化是目前研究的熱點,尚無一種公認的最佳方法,采用將成骨細胞與骨髓基質干細胞直接混合培養的方法目前尚無文獻報道,本實驗結果初步證實了該方法的有效性,該方法可能成為一種新的骨組織工程種子細胞獲取方法。 |
