引言 HIV抗體初篩實驗最常見方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），實驗中許多因素使結果產生不確定性，現(xiàn)作如下探討。
1 一般資料 2001/2007入伍新兵26600名血清標本進行HIV抗體測定，常規(guī)抽取靜脈血，低速離心分離血清，在2h內嚴格按照說明書完成測定。酶標儀為DENLEY DRAGON WE Scan MK2型自動酶標儀，洗板機為Stat fax-2600型洗板機，移液器為eppendorf電子可調移液器，試劑盒由北京金豪制藥有限公司生產; 臨界值設定為cutoff值=0.1+N（ 陰性對照平均值）。標本A值小于cutoff值為陰性，大于或等于cutoff值為陽性；陰性對照A值小于0.02時，按0.02計算；陽性對照A值小于0.5，陰性對照A值大于0.1，實驗不成立。 結果全部標本HIV抗體陰性。標本溶血，加樣快慢，孵育顯色時間，采用單、雙波長測定，洗滌液濃度等均對ELISA測定HIV抗體有較大影響。
2 討論
2.1 標本采集與保存 ①避免溶血：血紅蛋白含有血紅素基團，有類似過氧化物作用，以辣根過氧化物酶（HRP）標記的ELISA實驗中，血清標本中血紅蛋白與HRP反應顯色出現(xiàn)假陽性結果；②冰凍保存血清樣本須避免反復凍融：反復凍融標本所產生機械剪切力對蛋白等分子產生破壞作用，從而產生假陰性結果［1］；③待血液標本完全凝固方可加樣，否則因反應孔內出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留紅細胞出現(xiàn)假陰性結果。
2.2 試劑準備 實驗前將試劑從冰箱取出，室溫放置20min以上以與室溫平衡，使反應微孔內溫度較快達到37℃，防止弱陽性樣本出現(xiàn)假陰性。
2.3 加樣與試劑 垂直加樣（試劑）不可太快，以防止濺出和產生氣泡，若加樣過快，難以保證加樣量的準確性。非垂直加樣易加在微孔非包被區(qū)，致非特異性吸附。加樣過猛易使樣本（試劑）濺出對鄰近孔產生污染，產生氣泡使液面差異致酶標儀測定出現(xiàn)誤差。為確保加入試劑的準確性，應使用精密移液器，不可使用滴瓶滴加。
2.4 孵育 孵育是決定ELISA測定成敗關鍵環(huán)節(jié)，所需時間與溫度成反比，最常用的孵育溫度為37℃，30min。①反應時間：通常在加樣（試劑）后，將微孔放入水浴箱時，孔內溫度從室溫升至37℃需一定時間，尤其在室溫較低及非水浴狀態(tài)下，升溫時間會較長；如將微孔從放入水浴箱開始計時，使實際水育時間不夠，導致弱陽性標本漏檢。為保證設定溫度下有足夠孵育時間，可依據(jù)本實驗室不同環(huán)境溫度下微孔板從室溫至孵育箱后達設定溫度需要時間長短確定在孵育箱中孵育時間；②孵育溫度：國產HIV抗體初篩ELISA試劑一般為37℃，30min；進口試劑可有37℃，1h；從抗原抗體反應本質來說，在較低溫度下，反應較長時間最佳。在較高反應溫度下，由于分子運動，反應時間縮短，對強陽性樣本測定無影響，但對分子含量較少的弱陽性樣本則有漏檢可能；③“邊緣效應”：產生邊緣效應的原因可能與微孔板周孔與中心孔、孔周與孔中心表面熱力學特征不同有關，研究證實熱力學梯度是造成“邊緣效應”的根本原因［2］。建議盡量使用水浴或將反應溶液與微孔板先加熱至設定溫度，即可避免“邊緣效應”。
2.5 洗滌 ①固相免疫測定技術是一種非均相測定技術：需要洗滌將反應過程中非特異性吸附成份洗滌，以確認抗原抗體特異性結合；常用HIV抗體ELISA初篩試劑盒均以HRP(HRP)作為標記物的洗滌液，一般為含0.005g/L Tween20中性PBS，Tween20濃度不可過高，超過0.02g/L可使包被于固相上的抗原解吸附而影響實驗測定下限；為防止洗板機洗滌后有液體殘留，建議洗完后在吸水紙上拍干；②按要求次數(shù)洗滌。洗滌次數(shù)過少會因酶殘留導致假陽性結果（花板）［3］，洗滌次數(shù)過多會導致假陰性結果。
2.6 顯色 常用HIV抗體ELISA試劑盒多以HRP為標記酶，以四甲基鄰苯胺（TMB）為底物。從理論上講，在37℃，30min才可使底物催化完全，在最初10min內絕大部分催化反應即可完成。雖然試劑盒要求放置10min，為使弱陽性樣本有充分顯色，建議在37℃反應20-30min后終止反應進行測定為好。
2.7 雙波長測定 ELISA測定中空白孔非特異性吸附具有不確定性，故測定時最好使用雙波長。
2.8 空白設定 一般試劑盒均要求設空白，但我們在實際操作中發(fā)現(xiàn)，如使用雙波長測定無需設空白，在使用單波長測定時可設空白，并不影響實驗結果。如使用雙波長測定并設空白可能會造成陰性孔吸光度值為負數(shù)現(xiàn)象，使結果判讀難以解釋。
【參考文獻】
［1］赫啟昌，賀霞，杜曉靜，等。HIV抗體檢測弱陽性結果分析［J］。中國公共衛(wèi)生，2006，6：696。
［2］季陽，賈桂芹，張永剛。HIV抗體篩查與確證［J］。中國輸血雜志，1994，4：179-181。
［3］于振喜，李連潔。用HIV法檢測HIV抗體時如何避免“花板”？［J］。中國醫(yī)藥導報，2006，23：56。 |
