【實驗?zāi)康摹?
了解脈沖凝膠電泳的工作原理，并學(xué)習(xí)和掌握有關(guān)的操作技術(shù)。
【實驗原理】
大分子 DNA( 一般長度超過 20kb ，在某些情況下，超過 40kb) 在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直，與電場平行從而才能通過凝膠。此時，大分子通過凝膠的方式相同，遷移率無差別 ( 也稱 “ 極限遷移率 ”) ，不能分離。脈沖場凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在 10 ～ 2000kb 之間的 DNA 片段。這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的， DNA 分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小， DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的 DNA 移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。在許多實用的 PFGE 方法中，倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳是最簡單最常用的方法 (FIGE) 。通過把一個在不同電場方向有不同脈沖方式的脈沖電場加在樣品上，倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳 (FIGE) 設(shè)備能把大小范圍在 10 ～ 2000kb 的 DNA 片段分開。 FIGE 也可通過重新確定一個對準完全固定好角度的電場，這樣會進一步擴展其分離極限達到 10Mb 。
【儀器、材料與試劑】
1、制備 DNA 樣品所需材料：
1)TEN 緩沖液 (0.1mol/LTris ， pH7.5 ； 0.15mol/LNaCl ； 0.1mol/LEDTA) 。
2)Seaplaque 瓊脂糖 (EC 緩沖液中濃度為 2%) 。
3)EC 緩沖液 (6mol/LTris ， pH7.5 ； lmol/L NaCl ； 0.5% Brij58 ； 0.2% 脫氧膽酸鹽 (Deoxycholate) ； 0.5% 十二烷基肌氨酸鈉 (Sarcosyl) 。
4)ESP 緩沖液 (0.5mol/L EDTA ， 1% 十二烷基肌氨酸鈉， lmg/mL 蛋白酶 K) 。
5) 溶葡萄球菌素 (5mg/mL) 。
6)RNase(10mg/mL) 。
7) 膠模 ( 由常規(guī)瓊脂糖凝膠制得或購買成品 ) 。
8) 苯甲基橫酰氟 (PMSF)(17.4mg/mL 于乙醇中 ) 。
9)0.5μg/mL 溴化乙錠
2、分離、純化大的 DNA 片段所需材料：
1) 紫外遞質(zhì)。
2)10mg/mL tRNA 。
3)5mol/L NaCl 。
4) 苯酚 / 氯仿。
5)3mol/L NaAc ， pH5.2 。
6)95% 乙醇。
3、設(shè)備：
1)TBE 緩沖液。
2)Seakem HGT 瓊脂糖。
3)Wide Mini-Sub Cell 凝膠電泳設(shè)備。
4) 變速泵或蠕動泵 (Bio-Red Laboratory) 。
5)IBI FIJI 600 HV 程序性開關(guān)設(shè)備。
6) 緩沖液冷卻循環(huán)器 (Fotodyne ， New Britain ， WI) 或 Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory) 。
【實驗步驟】
1、 脈沖電場凝膠電泳的 DNA 樣品的制備：
為避免大分子 DNA 在提取過程中斷裂，細胞需在瓊脂糖凝膠塊中進行原位裂解，在本實驗中，我們使用金黃色葡萄球菌 (StapHylococcus aureus) 作為例子。
1) 取 100mL 對數(shù)生長期金黃色葡萄球菌細胞于 4 ℃ ， 5000g 離心 5min 。
2) 用 20mL TEN 緩沖液沖洗沉淀，同樣條件離心 5min 。之后用 10mL EC 緩沖液使細胞懸浮。
3) 取 1.5mL 細胞樣品與相同體積含 2%SeaPLaque 瓊脂糖的 EC 緩沖液迅速混合混勻并等分流溶液至封閉的模塊中于 4 ℃ 凝固，混合前加熱至瓊脂糖熔解并冷卻至 50 ℃ 。
4) 對于每一個菌株，需要 15 ～ 20 個凝膠塊，將它們放至含有 30 ～ 45μg/mL RNase(50mL 的 10mg/mL 的 RNase) 的 10mL EC 緩沖液中，于 37 ℃ 振搖過夜。
5) 去掉裂解緩沖液，換為 10mL ESP 緩沖液于 50 ℃ 輕度振搖溫育 48h 。
6) 將凝膠塊放在 10mL 含有 174μg/mL 苯甲基磺酰氟 (PMSF) 的 TE 緩沖液中，室溫溫育 4h(2h 換液一次 ) ，以滅活 ESP 中的蛋白酶 K 。
7) 用 TE 清洗瓊脂塊 6h(2h 換液一次 ) ，置于 TE 中 4 ℃ 保存。
2 、 限制酶消化：
提高 PFGE 的分辨率取決于 100 ～ 1000kb 片段電泳結(jié)果的重復(fù)率，它與酶切關(guān)系密切，可在瓊脂糖凝膠塊中使用合適的內(nèi)切酶消化。
1)25μL10× 反應(yīng)緩沖液， 30U 限制酶，加雙蒸水至 250μL 混勻。
2) 取一個凝膠塊置其中，合適溫度下溫育過夜 ( 按內(nèi)切酶要求 ) 后，用 TE 緩沖液洗滌并貯存。
3 、 應(yīng)用 PFGE 對樣品 DNA 進行分析：
1) 用 0.5×TBE 緩沖液制備一個 0.8%SeakemHGT 瓊脂糖凝膠，膠的厚度盡量與樣品凝膠塊相符。若用 Wide Minisub Cell 進行電泳的話， 50mL 該溶液即可。
2) 膠凝后，小心移去樣品梳。將凝膠塊用小刀切成與加樣孔一致的大小，將樣心地插入加樣孔，避免產(chǎn)生氣泡。 ( 若樣品在溶液中，以 l:1 的比率與 50 ℃ 2%Seaplaque 瓊脂糖相混合，迅速注入加樣孔中 ) 。
3) 把膠放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液，剛好覆蓋膠的表面即可，緩沖液事先 14 ℃ 冷卻。
4) 將電泳槽和一個連著穩(wěn)壓電源的程序性開關(guān)設(shè)備相連。打開電源，調(diào)節(jié)蠕動泵到適當流速 (5 ～ 10mL/rain) 或打開變速泵至 40 。
5) 通過計算機啟動極性轉(zhuǎn)換程序。大于 50kb 的限制性片段在 1.2s 和 0.4s 正向和反向的電脈沖下得以分離，時間一般為 3.5h 或更長。小于 50kb 的限制性片段在 0.4s 正向和 0.2s 反向的電脈沖 ( 比率為 2:1) 下得以分離，時間為 3 ～ 5h 。
6) 在 0.5μg/mL 溴化乙錠中進行染色并拍照。
4 、 分離、純化大的 DNA 片段：
1) 凝膠染色、分析后，在目的帶前 ( 靠近正極處 ) 切一個 0.25cm2 左右的槽，注入 0.8%Seaplaque 瓊脂糖，使之凝固。
2) 重新打開極性轉(zhuǎn)換開關(guān)，用紫外遞質(zhì)檢測 DNA 的遷移，當目的帶進入 Seaplaque 凝膠中時，關(guān)閉開關(guān)，切下目的帶，移至 1.5mL EP 管中。
3) 加入 2μL 的 tRNA ， 30μL 5mol/L NaCl ， 370μL 蒸餾水，在 65 ～ 70 ℃ 之間，化膠并保溫 10min 。
4) 苯酚 / 氯仿 500μL 抽提兩次。
5) 用 2.5 倍體積 95% 乙醇和 1/10 體積 NaAc(3mol/L ， pH5.2) 于 -70 ℃ 10min 沉淀水相。再用 70% 乙醇洗兩次并將沉淀溶于 TE 緩沖液中。
【注意事項】
1 、 換緩沖掖時盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠。
2 、 PMSF 是一個強烈的蛋白酶共價抑制劑，即有毒又揮發(fā)，操作時應(yīng)在通風(fēng)櫥中進行。
3 、 用蛋白酶 K 包埋的材料時 50 ℃ 溫育時間很長 (24 ～ 48h) ，有些學(xué)者提出如此長時間不必要 (Mortimer et al.1990) ，且可能造成高分子質(zhì)量 DNA 降解。在實驗中可視情況而定。
4 、 瓊脂糖凝膠塊在 TE(pH7.6) 中 4 ℃ 可存放數(shù)年，如在 0.5mol/L EDTA 中可存放更長時間。
5 、 一些高壓電源并不適合脈沖電場凝膠電泳，因為這些電源設(shè)計時均帶有保護電路，它可以檢測到負載的突然降低并且引發(fā)外加電源自動關(guān)閉。
6 、 由于電壓較高，就會產(chǎn)生熱量，為了保證溫度為 14 ℃ ，需要一些冷卻設(shè)備 ( 緩沖液冷卻循環(huán)器或 MiniChiller) 。此外，把電泳系統(tǒng)放在一個敞口的冰盒中也可保持恒溫。 |
