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污染的類型 細胞培養(yǎng)過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。 一、細菌污染 細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。 二、真菌污染 真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。 三、支原體污染 支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。 培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。 四、病毒污染 采用組織細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細胞含EB病毒，細胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細胞系。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。 五、非同種細胞污染 由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，操作不當，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在句卻認為是HeLa細胞。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。 非細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。 污染來源及鑒別 一、污染來源 細胞培養(yǎng)過程中污染的來源主要有以下幾條途徑： 1、不潔的動物組織標本 很多動物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外)，但由于取材時不小心也會有污染的機會。組織本身含有細菌，如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會帶菌，造成細胞污染。 2、空氣 空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺使用過久，濾板未定期更換或長久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時不帶口罩或外界氣流過強，污染空氣進入操作區(qū)，也會導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。 3、清洗消毒 培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不徹底也會引入微生物和有毒物質(zhì)。 4、操作 來自操作者的污染主要有以下幾方面： (1)器材和溶液使用前未仔細檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過，或者雖經(jīng)處理，時隔已久又末重新處理。 (2)操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細菌和支原體。 (3)培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。 (4)操作者不當心，動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。 (5)操作者操作時大聲說話，來回走動揚起灰塵等。 5、血清 市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。 二、污染的鑒別 1、細菌、真菌污染的檢測 (1)肉眼觀察 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。 (2)鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。 (3)接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 2、支原體污染的檢測 (1)相差顯微鏡觀察 將細胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的支持物(一般用長形蓋玻片)，24小時后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察;若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。 (2)低漲處理地衣紅染色觀察 取已在培養(yǎng)瓶中的支持物蓋片或培養(yǎng)液，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細胞。用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。用培養(yǎng)液時，先吸取1mL，500～800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL，將0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定，離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3張涂片。然后用2%醋酸依地紅(地衣紅2g，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL)染5分鐘。純酒精過三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹膠中。若染色過深，可先用75%酒精脫色，再封片。鏡下觀察見支原體呈暗紫色小點，位于細胞外或細胞之間。 (3)熒光染色法觀察 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細胞接種在蓋片上，在細胞匯合前(即未長滿前)取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。 (4)電鏡檢測 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養(yǎng)48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進行觀察。詳細方法同細胞形態(tài)觀察法(見第九章)。 (5)培養(yǎng)檢測 將2.5×109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基(Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可)，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。 污染的清除和預(yù)防 一、污染的清除 培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之;有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細胞，再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。 1、使用抗生素 抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進行治療。近年來有報道，4-氟，2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilin derivative, BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆茫褂脻舛菴ip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。 2、加溫處理 將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預(yù)試驗，摸索能最大限度殺死支原體又對細胞影響最小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。 3、使用支原體特異性血清 用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟。 4、其他方法 除了上述去除污染的方法外，還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養(yǎng)。 二、污染的預(yù)防 預(yù)防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手： 1、從物品、用品消毒滅菌著手 細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。 2、從操作者做起 (1)操作者責(zé)任心要強，要細心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。 (2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。 (3)操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。 3、防止細胞交叉污染 在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，最好做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時易發(fā)生混亂。 在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。 所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。 lonza 無血清 培養(yǎng)基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html |
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