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細(xì)胞培養(yǎng)基
市場(chǎng)上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基：
干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是配制過(guò)程繁瑣，質(zhì)量不易控制；
液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)模化生產(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便
常用的培養(yǎng)基種類：
RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys 5A、 M199、F10等
1000 ml RPMI1640培養(yǎng)基
RPMI1640干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）
蒸餾水400ml
↓
磁力攪拌至完全溶解
↓
加三蒸餾水定容至1000ml
在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過(guò)濾器除菌，并分裝成200 ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
用前取一瓶溶解，每200 ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100 U/ml。
↓
細(xì)胞培養(yǎng)液
血清
熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清
熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，還會(huì)影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且細(xì)胞貼壁率降低。
血清中的沉淀物：
— 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000 rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理
— 顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清
平衡鹽液體
組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分，用于洗滌組織、細(xì)胞等
（Phohate-Buffered Sallines）：
KCl 0.20g KH2PO4 0.20g
NaCl 8.00g Na2HPO4•7H2O 2.16g
D（Dulbecco’s Phohate-Buffered Sallines）標(biāo)準(zhǔn)型
CaCl2(無(wú)水氯化鈣) 0.10g KCl 0.20g
KH2PO4 0.20g MgCl2·6H2O 0.10g
NaCl 8.00g Na2HPO4·7H2O 2.16g
D-Hanks’ 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutio, D-H)
KCl 0.40g KH2PO4 0.06g
NaCl 8.00g NaCO3 0.35g
Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g
消化液：分離組織和分散細(xì)胞
— 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液
— 單獨(dú)或混合使用
胰蛋白酶溶液
— 主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散
— 消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用
— 胰蛋白酶溶液配制
1、稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時(shí)或冰箱過(guò)夜，不斷攪拌振蕩
2、次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過(guò)濾除菌，分裝入瓶中， -20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐ВＳ脻舛葹?.25% （0.1%-0.5%）
3、胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右
EDTA·4Na 溶液
— 一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，毒性小，價(jià)格低廉，使用方便
— 常用工作液濃度為0.02%。
注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)
— EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存
pH 調(diào)整液
— NaHCO3 溶液
常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過(guò)濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存
— HEPES（分子量238.31）溶液
1、一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性
2、主要作用：防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES
3、使用終濃度一般為10-50mmol/L
4、常配成1M 儲(chǔ)存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過(guò)濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2ml HEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L
谷氨酰胺補(bǔ)充液
— 谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加
— 配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)，使用終濃度為1-4 mmol/L。
— 一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200 mmol/L（29.22 g/L）
— 配制方法為 ：
谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100 ml 培養(yǎng)液中加入0.5-2 ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4 mmol/L
酚紅
— 大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示：
紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH；
— 在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅：
因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用
抗生素溶液
— 抗生素使用種類與濃度：
抗生素 工作濃度 儲(chǔ)存溫度 殺滅細(xì)菌
penicillin(青霉素) 100 u/ml -20℃ G(+)
streptomycin(鏈霉素) 100 ug/ml -20℃ G(+) 、G(-)
gentamicin(慶大霉素) 50 ug/ml -20℃ G(+)、G(-)、支原體
amphotericin B(潮霉素B) 2.5 ug/ml -20℃ 真菌
nystatin(制霉菌素) 50 ug/ml -20℃ 真菌
哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存
— 冷凍保存要點(diǎn)：
1、冷凍過(guò)程要緩慢
4℃ 30－60 分鐘
↓
-20℃ 30 分鐘
↓
-80℃ 16－18 小時(shí)（或過(guò)夜）
↓
液氮長(zhǎng)期保存
2、凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無(wú)微生物污染。
3、細(xì)胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。
— 常用細(xì)胞冷凍保存液
10％DMSO ＋ 完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
10％甘油＋ 完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)
— 快速解凍
1 凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò)3 分鐘）；
2 解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24 小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO；
3 如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中
— 解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法
1 從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴中快速解凍；
2 將1－2ml 凍存細(xì)胞液加入到25ml 新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，輕輕混勻
3 用80g 離心2－3 分鐘，棄上清液
4 用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞
5 接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。
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