Clonetics原代細胞及培養基系統

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一、原理

將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。

二、儀器、材料及試劑

儀器：培養箱（調整至37℃），培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱（37℃）

材料：胎鼠或新生鼠

試劑：1640培養基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank's液，碘酒

三、操作步驟

（一）胰酶消化法

1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長，以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。

2、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。

3、用手術剪將肝臟剪成小塊（1mm），再用Hank's液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。

4、視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。

5、加入3-5ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。

6、靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。

8、加入Hank's液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。

9、加入培養液l-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。

10、將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25ml細胞培養瓶中，37℃下培養。

上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質酶等）。

（二）組織塊直接培養法

自上方法第3步后，將組織塊轉移到培養瓶，貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上，將培養液加至瓶中，培養液勿接觸組織塊。入37℃靜置3―5小時，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），37℃繼續培養。

四、注意事項

1、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

2、在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。

3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

五、無菌操作的幾個注意事項

1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

5、瓶子開口后要盡量保持45^。斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。

附：Hank's液配方：

KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至1000ml。

注：Hank's液可以高壓滅菌，4℃下保存。

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