無血清培養基  網址鏈接http://www.gducity.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2014/0514/5157.html

無菌操作基本技術

1、實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2、無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。

3、小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4、工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5、定期檢測下列項目：

5.1. CO₂ 鋼瓶之CO₂ 壓力。
5.2. CO₂培養箱之CO₂ 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300 小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。

6、水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

培養基

1、液體培養基貯存于4 ℃ 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。

2、液體培養基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。

3、粉末培養基配制(以1 升為例)：

3.1. 細胞培養基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO₂氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。

3.2. 材料：

3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要)
3.2.2. 粉末培養基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體

3.3. 步驟：

3.3.1. 取粉末培養基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO₃ 粉末(數量依培養基種類而異，表一)溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO₂ 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO₂ 之NaHCO₃ 溶液加入溶解之液體培養基中混合。混后溶液之pH 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO₂氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4 ℃。(血清亦可加入培養基中一起過濾) 。
3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。

4. 配制培養基之生長測試

4.1. 材料：

4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步驟：

4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 ×102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。
4.2.3. 去除培養基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳，則丟棄之。

細胞傳代培養

1、細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。

2、材料：

2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 ℃，使用前放在37 ℃ 水槽回溫。

2.3. 新鮮培養基

2.4. 無菌吸管/離心管/培養瓶

3、 步驟：

3.1. 附著型胞(adherent cell)

3.1.1. 吸掉舊培養液。

3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm², 2ml/75cm²)，37 oC 作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。)

3.1.4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

3.2. 懸浮型細胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

3.3. 融合瘤(hybridoma)

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基，直接添加新鮮培養基 稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養瓶中。

收到細胞的處理方式

細胞活化

1、收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養， 或立即冷凍保存(置于–70℃，隔夜后，移到liq N₂)。

2、冷凍細胞解凍程序

2.1. 依據細胞株數據單指定之基礎培養基種類、血清種類和其它指定之成份和比例， 制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單指定之血清種類培養之。

2.3. 將培養基置于37 ℃水槽中回溫， 回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取出冷凍管， 立即放入37 ℃ 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。

2.4. 依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取10 ml 培養基加至T25 或T75 flask 中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養基， 混合均勻，放入37 ℃，5 % CO₂培養箱培養。

2.5. 對絕大多數細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需 立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后， 轉移至培養瓶中， 再放入37 ℃， 5 % CO₂培養箱培養。

收到T25 flask 細胞時， 處理方式為

1、由于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2、將原封之T25 flask 靜置于37 ℃， 5 % CO₂ 培養箱中，使細胞回溫至37 ℃， 并讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask 內之培養基，(取出之培養基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養基于flask 內，依一般培養方式再將細胞置入培養箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養。

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