簡介

 T 細胞在免疫細胞介導的靶向腫瘤治療中起到重要作用。使用體外活化擴增的 T 細胞進行過繼性免疫療法正在成為臨床環境中治療癌癥的有力工具。多篇報道指出了使用含有各種細胞因子（如 IL-2， IL-7，和 IL-21）可用于 T 細胞的活化和擴增。血清補充劑（如人自體血漿）是 T 細胞體外活化與擴增的重要添加劑。在本研究中，我們利用白細胞介素 -2（IL-2），抗人 CD3 抗體和抗人 CD28 抗體展示了康寧 88- 581-CM 培養基對人 T 細胞體外活化與擴增的應用。同時研究了使用含有或不含 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養基體外培養人 T 細胞的相關結果。

材料和方法

  外周血單核細胞（PBMC）的制備

外周血單核細胞使用康寧淋巴細胞分離液 (LSM)(Corning  Cat.No.25-072-Cl)，按照產品使用說明提供的操作方法，從人源新鮮的外周血中分離獲得。獲得的外周血單核細胞用不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌三次，離心去除多余的淋巴細胞和少量的殘留的紅細胞。離心參數設置如下： 第 1 次： 室溫，1500 rpm/min，10min；第 2 次：室溫，1200 rpm/min，10min；第 3 次：室溫，1000 rpm/min，10min。

  人 T 細胞的體外擴增

  通過免疫磁珠分選 CD3+ T 細胞，使用 EasySep™人 T 細胞分離試劑盒 (STEMCELL Technologies Cat. No. 17951) 從新鮮 PBMC 中分選人 CD3+ T 細胞。將 CD3+ T 細胞 (1×106 個細胞 / mL) 懸浮于含有 1µg/mL 抗人 CD28 抗體和 200 IU/mL IL-2 (Corning Cat. No. 354043) 的含有或不含自體血漿的Corning 88-581-CM 培養基中。將含有 2×106 個細胞的細胞懸液接種到用 5µg/mL 抗人 CD3 抗體預包被的 6 孔細胞培養板 (Corning Cat. No. 3516) 中的一個孔中，并在 37℃，5% CO2 的恒溫的培養箱中培養 3 天。在第 4 天至 14 天，添加含有或不含人自體血漿的 200 IU/mL IL-2 的新鮮 Corning 581- 88-CM培養基將細胞密度維持在5×105 至2×106 個細胞/mL 之間。每天觀察細胞形態，培養至14 天， 離心收獲細胞。

 表型分析

 在第 0 天和第 14 天收集 T 細胞樣品，利用流式細胞儀對細胞表面標記物進行鑒定分析。本研究中， 我們通過檢測兩組T  細胞表面標記物（CD3+/CD8+、CD4+/CD45RO-）的表達水平來評價體外擴增后的 T 細胞質量。具體操作參考 BD 提供的流式細胞檢測標準流程， 不同標記的細胞表面標記物抗體， 按 1:1 抗體 /105 細胞的比例，4℃避光孵育 15min 后，PBS 洗滌后利用 300uL PBS 重懸細胞并用流式細胞儀進行表性分析，同型對應抗體作為對照。

結果

 將人 T 細胞在含有和不含 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養基中培養兩周。培養過程中出現細胞團簇與血漿的有無并無直接關系。圖 1 的結果表明補充含有 2% 血漿的細胞比在不含血漿的培養基中培養的細胞形成更多的細胞團簇。

 含有 2% 自體血漿的康寧 88-581-CM 培養基

 當人 T 細胞在含有 2% 血漿的康寧 88-581-CM 培養基中培養時，到第 10 天時細胞會迅速增殖 100 倍至超過 1 億個細胞。 第 14 天收獲時，細胞已經擴增了 250 倍約 6 億個細胞。相比不加血漿的康寧
88-581-CM 培養基，添加 2% 的自體血漿的 88-581-CM 培養基可明顯增加T 細胞的體外擴增能力（如圖 2）。

圖 1. 培養第 10 天細胞形態 (A) 含有 2% 自體血漿的康寧 88-581-CM 培養基中培養的細胞。 (B) 不含血漿的康寧 88-581-CM 培養基中培養的細胞。 。

 圖 2. 使用含有 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養基的細胞生長和倍數擴增。不含自體血漿的 Corning® 88-581-CM 培養基為了評估不含自體血漿的康寧 88-581-CM 培養基的擴增結果，我們將其與競爭品牌 G 同時進行 T 細胞的無血清體外擴增，并比較其擴增結果。當T 細胞在不額外添加血漿的培養基中培養至第 14 天時， 細胞產量（~2×108 個細胞）和擴增倍數（~100 倍；如圖 3）兩者沒有顯著差異。接下來我們評估了康寧 88-581-CM 培養基在特定 T 細胞亞型擴增中的應用。CD8+T 細胞能夠殺死癌細胞和病毒同時產生細胞因子，足夠數量的初始 T 細胞對于病原體的連續應激反應是必不可少的。使用康寧 88-581-CM 培養基培養后，CD8+T 細胞和初始 T 細胞比例分別為 90.9% 和 5.3%，高于競爭品牌 G 培養基（分別為 89.1% 和 1.4%；如圖 4）。

圖 3. 細胞在康寧 88-581-CM 和競爭品牌 G 培養基中無血清培養 14 天增殖能力的比較。

圖 4. 細胞在康寧 88-581-CM 培養基和競爭品牌 G 培養基擴增 T 細胞的表型分析。CD3+/CD8+ 為CD8+T 細胞；CD+/CD45RO- 為初始 T 細胞。此外，我們也評估了擴增 2×108 個 T 細胞所需的培養基總成本。康寧 88-581-CM 培養基的成本非常具有優勢。在中國地區，其僅為競爭品牌 G 培養基成本的三分之一。

結論

康寧 88-581-CM 培養基可以在無血漿或低自體血漿條件下成功活化和擴增 T 細胞，獲得高表達的CD8+ T 細胞和初始 T 細胞。雖然康寧 88-581-CM 培養基與競爭品牌 G 的培養基之間在 T 細胞增殖能力上沒有顯著差異，但在效應 T 細胞的比例上有明顯優勢，且成本更低，為研究人員提供了更好的選擇。

保修/ 免責聲明：除非另有規定，所有產品僅供研究使用。不適用于診斷或治療程序。不適用于人類。康寧生命科學從未聲稱這些產品可以用于臨床或診斷應用。

Corning® KBM 581 淋巴細胞無血清培養基

北京畢特博生物技術有限責任公司

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