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前言 間充質干細胞（Mesenchymal stem cell, MSC）來源于發育早期的中胚層，具有多向分化潛能、造血支持和 促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點，在生物醫學領域引起越來越多的關注。MSC可以從骨髓、脂 肪組織、滑膜、皮膚、牙髓以及胎兒附屬物如胎盤、臍帶血和臍帶中分離獲得1-3。盡管骨髓是最廣泛使用的 骨髓間充質干細胞的來源，但是骨髓穿刺的侵襲性再倫理上限制了其應用方向的可行性，并且骨髓間充質干 細胞的增殖分化能力普遍隨著供體年齡增加而下降。臍帶是優質的MSC的來源組織，臍帶來源的MSC具有增 殖能力、分化能力強等優點，并且其取材不涉及倫理問題，具有廣泛的應用前景4-5. 康寧MSC Xeno-Free SFM間充質干細胞無血清培養基化學成分明確，不包含血清及其他任何人源以外成分， 使用方便，無需額外添加物，可支持不同來源（骨髓/脂肪/臍帶來源）間充質干細胞多次傳代培養。
材料
臍帶組織
Corning® MSC Xeno-Free SFM間充質干細胞無血清培養基 (Corning, Cat. No. 88-600-CV)
Corning® CellBIND® 75cm² 細胞培養瓶 (Corning, Cat. No. 3290)
10 cm細胞培養皿 (Corning, Cat. No. 430293)
TrypLE™ Select Enzyme (ThermoFisher, Cat. No. 12563029)
磷酸鹽緩沖液PBS (Corning, Cat. No. 21-040-CV)
實驗步驟
臍帶來源MSC的分離和培養
1.在生物安全柜中，將臍帶從50 mL離心管中取出轉移至10 cm細胞培養皿中，用無菌手術剪將臍帶盡可能 剪碎，臍帶碎片以不超過1 mm大小為佳。
注：臍帶來源MSC的分離和培養整個過程嚴格保持無菌狀態，否則可能因污染導致MSC細胞分離培養 失敗。
2.用無菌PBS漂洗臍帶組織塊2次，1,000 x g離心5分鐘，棄上清。
3.用10 mL康寧間充質干細胞無血清培養基重懸臍帶碎片，隨后將懸液轉移至CellBIND® 75cm² 細胞培養 瓶（T75）中，置于37℃，5%CO2 環境中培養。
注：康寧間充質干細胞無血清培養基使用時無需對培養表面進行包被處理，但我們推薦使用CellBIND® 表面進行培養，可以使MSC更好地貼壁。 可選擇添加5% human platelet lysate（HPL）可明顯加速MSC 細胞爬出與生長。
4.培養最初7天無需更換培養基，培養至第7天時，顯微鏡下可觀察到臍帶碎片周圍出現貼壁單細胞，將 培養基更換為新鮮培養基。
5.繼續培養至第12天時，顯微鏡下觀察在臍帶碎片組織周圍出現MSC，更換一半培養基為新鮮培養基。
6.培養至第15天左右，MSC細胞融合度至約90%-100%，MSC細胞可進行收獲或進行傳代。
7.傳代后的MSC 細胞可直接用Corning MSC SFM 培養擴增，無需加任何 HPL 或 血清替代物。 MSC的收獲、傳代和鑒定
8.預熱PBS, TrypLE™ Select Enzyme至室溫。
9.用PBS漂洗細胞表面2次，棄去PBS，加入TrypLE™ Select Enzyme 37℃孵育2-3 min。
10.當細胞開始變圓并從培養瓶底部脫離，用移液管輕柔吹打成的單細胞懸液。
11.加入間充質干細胞無血清培養基，轉移至新的培養瓶，置于37℃，5%CO2 環境中繼續培養，每周更換2 次新鮮培養基。
12.MSC的鑒定可通過流式細胞術進行，檢定標準為：CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166等
表達陽性（95%以上）；CD14、CD31、CD34、CD45等表達陰性（2%以內）。
參考文獻
1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
4. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cellsderived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6),1384-1392 (2007).
5. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion,placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
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